曹 瑤 戚馨月 汪海峰 周建新

(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院；江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心；江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210023)

花生是世界上重要的油料作物[1]，全球每年花生果產(chǎn)量超過4 200萬t，殼產(chǎn)量約1 800萬t[2]。花生殼是花生產(chǎn)業(yè)的一種豐富而廉價(jià)的副產(chǎn)品，除少量被制成飼料，大多數(shù)被用作取暖和烹飪的燃料或者被當(dāng)作廢物丟棄，導(dǎo)致資源損失和環(huán)境污染[3]。研究表明，花生殼中富含黃酮類化合物，如木犀草素、圣草酚，5,7-二羥色原酮等[4]，作為植物的次生代謝產(chǎn)物，在預(yù)防和管理現(xiàn)代疾病如艾滋病[5]、癌癥[6]、炎癥[7]和肥胖[8]發(fā)揮重要作用。QIU等[9]采用HPLC-DAD-TOF/MS法對(duì)花生殼中的成分進(jìn)行鑒別，在花生殼的甲醇提取物中發(fā)現(xiàn)了3種化合物，分別為5,7-二羥基色原酮、圣草酚和木犀草素，含量分別為0.59、0.92、2.36 mg/g。左愛學(xué)等[10]從花生殼乙醇提取物中分離出12種化合物，分別鑒定為木犀草素、香葉木素、圣草酚、5,7-二羥基色原酮、大風(fēng)子素、5,7,3’,4’-tetrahydroxy-8-prenylflavone、5,7,3’-trihydroxy-4’-methoxy-8prenylflavone、racemoflavone、5-羥基-色原酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、谷甾醇、胡蘿卜苷。YU等[11]和CAMARGO等[12]發(fā)現(xiàn)花生殼提取物能夠抑制細(xì)菌的生長。戚馨月等[13]采用不同極性的有機(jī)溶劑分級(jí)提取，發(fā)現(xiàn)花生殼分級(jí)提取物對(duì)不同供試菌均有一定的抑制作用，其中乙酸乙酯提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng)。QIAN等[14]發(fā)現(xiàn)木犀草素可以破壞金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜的完整性，對(duì)細(xì)菌生物膜的形成具有較強(qiáng)的抑制作用。HE等[15]研究中發(fā)現(xiàn)圣草酚對(duì)編碼金黃色葡萄球菌外分泌蛋白Hla的基因hla表達(dá)和轉(zhuǎn)錄有明顯的抑制作用。然而，花生殼提取物的抗菌機(jī)理鮮見報(bào)道。食源性疾病仍然是世界范圍內(nèi)一個(gè)主要的公共衛(wèi)生問題，其主要原因是食用了細(xì)菌、病毒和寄生蟲等病原微生物污染的食品[16]。金黃色葡萄球菌，一種常見的食源性致病菌，進(jìn)入人體可引起許多急慢性感染[17]。本研究以金黃色葡萄球菌ATCC 6538為指示菌，分析花生殼提取物對(duì)其抗菌作用和機(jī)理，為開發(fā)食品天然防腐劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 指示菌及預(yù)處理

金黃色葡萄球菌ATCC 6538購于江蘇省疾病預(yù)防控制中心。將ATCC 6538接種于新鮮的胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后按2%轉(zhuǎn)接至新鮮TSB中，于(36±1) ℃，120 r/min 恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)18 h至生長對(duì)數(shù)后期，菌液經(jīng)12 000 r/min離心5 min，棄去上清液，使用無菌1×磷酸緩沖溶液(PBS)洗滌菌體沉淀，重復(fù)洗滌兩次后，使用一定量1×PBS重懸，調(diào)整菌液濃度為109CFU·mL-1，備用。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、TSB；氯化鈉、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二甲基亞砜(DMSO)，以上均為分析純；1×PBS、碘化丙啶(PI)、5(6)-羧基二乙酸熒光素(5(6)-cFDA)。

1.3 花生殼提取物的制備

花生殼洗凈后55 ℃烘干，用高速粉碎機(jī)磨碎成粉，過50目篩。準(zhǔn)確稱取5 kg花生殼粉用50 L 90%乙醇提取3次，每次3 h，合并提取液。減壓濃縮至無乙醇味，濃縮液加水稀釋至含生藥量0.25 g/mL，共20 L。依次用等體積石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取三次，合并相同溶劑萃取液，減壓濃縮，得到石油醚萃取部位浸膏51.56 g，乙酸乙酯萃取部位浸膏144.63 g，正丁醇萃取部位浸膏22.69 g，均置于-20 ℃冰箱備用。

1.4 儀器與設(shè)備

FW100型高速粉碎機(jī)，RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，LDZX-50FBS型立式壓力蒸汽滅菌器，酶標(biāo)儀，轉(zhuǎn)盤式激光共聚焦顯微鏡，掃描電子顯微鏡等。

1.5 方法

1.5.1 花生殼各萃取部位對(duì)ATCC 6538抗菌活性的測定

參照鄭東超等[18]方法，用DMSO復(fù)溶石油醚、乙酸乙酯及正丁醇萃取部位浸膏，配制成51.2 mg/mL的母液，各取1 mL將滅菌后直徑為6 mm的濾紙片浸泡于其中4 h，取出瀝干，以DMSO為對(duì)照。取1.1節(jié)中菌懸液均勻涂布于TSA平板上，將上述濾紙片平鋪于培養(yǎng)皿中。置于(36±1) ℃條件下培養(yǎng)24 h，按十字交叉法測量抑菌圈直徑。

1.5.2 乙酸乙酯萃取物對(duì)ATCC 6538抗菌作用的測定

1.5.2.1 MIC和MBC的測定

參照YE等[19]方法，取200 μL無菌TSB加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，再加入200 μL乙酸乙酯萃取物母液倍比稀釋，使其濃度分別為25.6、12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2 mg/mL，取1.1中菌懸液4 μL接種至96孔板中，以相同體積無菌水為空白對(duì)照，(36±1) ℃條件下培養(yǎng)24 h，測定OD600 nm。以O(shè)D600 nm無變化的最低濃度為MIC。將OD600 nm無變化的菌懸液在TSA平板上涂布，菌落數(shù)少于5個(gè)的最低濃度為MBC。

1.5.2.2 生長曲線及生長動(dòng)力模型的建立

參照SILVA-ANGULO等[20]方法，取1.1節(jié)中菌懸液以2%轉(zhuǎn)接至新鮮的TSB中培養(yǎng)至穩(wěn)定期，用無菌TSB調(diào)整菌液為104CFU·mL-1，再按1%分別轉(zhuǎn)接于新鮮的TSB中，向其中加入乙酸乙酯萃取物使其終濃度為1/4 MIC、1/2 MIC、MIC，以添加相同體積的TSB作為空白對(duì)照。置于(36±1) ℃培養(yǎng)，每隔2 h取樣在TSA平板上涂布，(36±1) ℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

選擇Baranyi模型來擬合其生長狀況，并表征菌株的生長參數(shù)。見式(1)：

(1)

式中：y(t)為t時(shí)刻菌濃度的對(duì)數(shù)；y0為初始菌濃度(t=0)的對(duì)數(shù)；ymax為最大菌濃度的對(duì)數(shù)；μmax為最大比生長速率；A(t)為調(diào)整方程，見式(2)、式(3)。

(2)

y0=μmax×λ

(3)

式中：t為培養(yǎng)時(shí)間；v為菌體在生長過程中的增長速率；λ為遲滯時(shí)間。

1.5.2.3 致死曲線的建立

參照王虹懿等[21]方法，取1.1節(jié)中菌懸液調(diào)整至107CFU·mL-1，加入乙酸乙酯萃取物溶液使其最終濃度為MIC、2 MIC及4 MIC，以相同體積1×PBS作為空白對(duì)照，置于(36±1) ℃靜置培養(yǎng)，每隔2 h取樣，在TSA平板上涂布，(36±1) ℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.5.3 乙酸乙酯萃取物對(duì)ATCC 6538抗菌機(jī)理的研究

1.5.3.1 細(xì)胞形態(tài)的觀察

參照趙梓雯[22]方法，取1.1中菌懸液調(diào)整至107CFU·mL-1，加入乙酸乙酯萃取物溶液使其最終濃度為MIC、2 MIC、4MIC、6 MIC和MBC，以相同體積1×PBS作為空白對(duì)照，置于(36±1) ℃培養(yǎng)4 h。10 000 r/min離心10 min，1×PBS洗滌2次，除凈上清液，在室溫下用2.5%的戊二醛固定3 h。10 000 r/min離心5 min，1×PBS洗滌2次，除凈上清液，將樣品依次用30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇溶液對(duì)樣品進(jìn)行洗脫，每次10 min。洗脫結(jié)束將樣品固定在鏡片上，置于鍍金儀中真空噴金90 s，拍照。掃描電鏡使用的電壓為10 kV，放大倍數(shù)為20 000倍。

1.5.3.2 細(xì)胞膜通透性的觀察

參照周祺等[23]和劉國榮等[24]方法，按照上述1.5.3.1中方法制備樣品后，10 000 r/min離心10 min，用1×PBS重懸，向每個(gè)樣品中加入5(6)-cFDA至終濃度達(dá)到2.5 μmol/L，避光反應(yīng)10 min；然后加入PI使其終濃度為0.5 μmol/L，避光反應(yīng)10 min。取5 μL菌液轉(zhuǎn)接到載玻片上，加上蓋玻片，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。激光共聚焦顯微鏡放大倍數(shù)為40倍空氣鏡，標(biāo)尺為110 μm。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用Origin8.5 軟件制圖，SPSS 22進(jìn)行顯著性分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生殼各萃取物部位對(duì)ATCC 6538的抑菌圈直徑

乙酸乙酯萃取部位有明顯的抑菌圈，直徑為(9.54±0.78) mm，石油醚萃取部位、正丁醇萃取部位及DMSO對(duì)照組均無抑菌圈。證明花生殼中抗菌活性物質(zhì)存在于乙酸乙酯萃取部位及該試劑可作為配制母液的溶劑。

2.2 乙酸乙酯萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC 6538的抗菌作用

2.2.1 MIC和MBC

當(dāng)乙酸乙酯萃取物樣品濃度大于或等于0.80 mg/mL時(shí)，樣品菌懸液OD600 nm無變化，由此確定MIC為0.80 mg/mL；當(dāng)濃度大于或等于6.40 mg/mL時(shí)，在TSA平板上菌落數(shù)均小于5，因此確定MBC為6.40 mg/mL。

2.2.2 生長曲線及生長動(dòng)力模型

Baranyi模型特別適用于有延滯、對(duì)數(shù)、穩(wěn)定三個(gè)階段的生長曲線，其既表達(dá)了微生物生長量與時(shí)間的關(guān)系，也較為準(zhǔn)確地評(píng)估微生物的遲滯時(shí)間(λ)、最大比生長速率(μmax)及最大生長量(ymax)等生長參數(shù)[25]。ATCC 6538經(jīng)不同濃度乙酸乙酯萃取物作用下在TSB中生長的Baranyi模型曲線如圖1所示。

注：—表示ATCC 6538在TSB中的Baranyi模型生長曲線。圖1 ATCC 6538在含有不同濃度乙酸乙酯萃取物的TSB中的生長曲線

由圖1可知，除濃度為MIC外，ATCC 6538在其他幾種濃度的乙酸乙酯萃取物中的生長量實(shí)測值皆比較均勻地分布于生長曲線的兩側(cè)。各擬合方程R2均大于0.97，說明利用Baranyi模型能很好地?cái)M合指示菌的生長狀況并表征其生長參數(shù)，ATCC 6538的生長參數(shù)統(tǒng)計(jì)如表1所示。

細(xì)菌的生長繁殖一般分為4個(gè)時(shí)期：延滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期[26]。由表1可知，在空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中，指示菌菌體初始濃度y0在2.317 0 ～2.755 0 lg CFU·mL-1之間，彼此相差小于1 lg CFU·mL-1。當(dāng)菌體生長達(dá)到穩(wěn)定期后，空白組與實(shí)驗(yàn)組之間的最大生長量ymax差異顯著(P<0.05)，對(duì)照組ymax為9.037 5 lg CFU·mL-1，濃度為1/2 MIC的ymax為6.474 3 lg CFU·mL-1，彼此相差接近3 lg CFU·mL-1，表明乙酸乙酯萃取物能夠抑制ATCC 6538生長，濃度越大抑制越明顯。添加乙酸乙酯萃取物的TSB中ATCC 6538的遲滯時(shí)間顯著(P<0.05)大于其在不含有萃取物的TSB中的數(shù)值，且呈現(xiàn)濃度依賴性。在乙酸乙酯萃取物作用后，ATCC 6538的最大比生長速率顯著減小(P<0.05)。

表1 ATCC 6538在含不同濃度乙酸乙酯萃取物的TSB中的生長動(dòng)力學(xué)參數(shù)

2.2.3 致死曲線

ATCC6538經(jīng)不同濃度乙酸乙酯萃取物作用下在1×PBS中的致死曲線如圖2所示。

圖2 ATCC 6538在不同濃度乙酸乙酯萃取物中的致死曲線

由圖2可知，不同濃度乙酸乙酯萃取物對(duì)其均有殺菌作用，添加乙酸乙酯萃取物的1×PBS中ATCC 6538的活菌數(shù)變化顯著(P<0.05)大于其在不含有萃取物的1×PBS中的數(shù)值。當(dāng)添加乙酸乙酯萃取物濃度為1/2 MIC時(shí)，作用14 h后活菌數(shù)下降至0；當(dāng)添加乙酸乙酯萃取物濃度為MIC時(shí)，作用8 h后活菌數(shù)下降至0；當(dāng)添加乙酸乙酯萃取物濃度為4 MIC時(shí)，作用2 h后活菌數(shù)下降至0，與空白對(duì)照組相比顯著縮短(P<0.05)。

2.3 乙酸乙酯萃取物對(duì)ATCC 6538的抗菌機(jī)理

2.3.1 細(xì)胞形態(tài)的觀察

ATCC6538經(jīng)過乙酸乙酯萃取物作用培養(yǎng)至穩(wěn)定期在掃描電子顯微鏡下的菌體形態(tài)如圖3所示。

圖3 經(jīng)不同濃度乙酸乙酯萃取物處理的ATCC 6538掃描電子顯微鏡照片

由圖3可知，空白對(duì)照組(圖3a)指示菌細(xì)胞圓潤飽滿、外形規(guī)則且表面光滑。MIC處理組(圖3b)少量細(xì)胞表面出現(xiàn)粗糙，2 MIC處理組(圖3c)細(xì)胞表面出現(xiàn)粗糙且少量外形皺縮，4 MIC處理組(圖3d)細(xì)胞之間開始出現(xiàn)黏連狀態(tài)，6 MIC處理組(圖3e)少量細(xì)胞出現(xiàn)干癟，MBC處理組(圖3f)大量細(xì)胞出現(xiàn)干癟?？梢钥闯鲆宜嵋阴ポ腿∥锬軌蚴怪甘揪?xì)胞生長時(shí)的形態(tài)發(fā)生變化，且隨著乙酸乙酯萃取物濃度的增加，細(xì)胞發(fā)生的變化越明顯。說明乙酸乙酯萃取物能夠?qū)е铝呀庵甘揪?xì)胞壁，使胞內(nèi)物質(zhì)流出。

2.3.2 細(xì)胞膜通透性的觀察

通過激光共聚焦顯微鏡觀察的經(jīng)乙酸乙酯萃取物作用的ATCC 6538菌體細(xì)胞膜通透性如圖4所示。

注：a CK；b MIC；c 2 MIC；d 4 MIC；e 6 MIC；f MBC，放大倍數(shù)為40。圖4 經(jīng)不同濃度乙酸乙酯萃取物處理的ATCC 6538激光共聚焦照片

經(jīng)過兩種核酸熒光探針5(6)-cFDA和PI染色后，可區(qū)分完整細(xì)胞膜和膜受損的菌體細(xì)胞。如圖4所示，空白對(duì)照組(圖4a)和MIC處理組(圖4b)的大部分菌體呈綠色熒光，2 MIC處理組(圖4c)大部分菌體細(xì)胞呈中間態(tài)橙黃色熒光，4 MIC處理組(圖4d)、6 MIC處理組(圖4e)和MBC處理組(圖4f)絕大多數(shù)細(xì)胞呈紅色熒光且紅色熒光。以上表明，在未經(jīng)過乙酸乙酯萃取物作用和低濃度作用的菌體細(xì)胞中大多數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞膜完整，細(xì)胞主要顯示為綠色熒光；隨著作用濃度的增大，PI逐漸進(jìn)入細(xì)胞與5(6)-cFDA競爭取代結(jié)合位點(diǎn)，熒光顏色由綠色轉(zhuǎn)變?yōu)槌赛S色或紅色，細(xì)胞膜受損程度增加。

3 討論

本研究首先通過濾紙片法研究了花生殼石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物及正丁醇萃取物對(duì)ATCC 6538的抗菌活性，發(fā)現(xiàn)其中主要抗菌成分在乙酸乙酯萃取部位。推測是因?yàn)橐宜嵋阴ポ腿∥锍煞种饕屈S酮類物質(zhì)，近年來研究報(bào)道表明花生殼提取物具有良好的抗菌活性，其主要活性物質(zhì)為黃酮類物質(zhì)[27]。

其次研究了乙酸乙酯萃取物對(duì)ATCC 6538的抗菌作用，確定其MIC為0.80 mg/mL，MBC為6.40 mg/mL。根據(jù)MIC和MBC濃度從指示菌的生長和致死2個(gè)角度探討了不同濃度對(duì)指示菌的抗菌作用，發(fā)現(xiàn)萃取物使指示菌延滯期變長，最大比生長速率降低且最大菌落數(shù)減少。這與已報(bào)道的花生肽亞鐵螯合物能夠使金黃色葡萄球菌生長緩慢且衰亡期提前報(bào)道相似[28]。

此外，從細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞膜的完整性2個(gè)角度分別探討了乙酸乙酯萃取物對(duì)ATCC 6538的抗菌機(jī)理。通過掃描電鏡檢測指示菌的細(xì)胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)萃取物作用后菌體細(xì)胞形態(tài)明顯被破壞，隨著濃度增大細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)皺縮干癟，細(xì)胞壁破裂，胞內(nèi)物質(zhì)流出。這也與已報(bào)道的野艾蒿提取物可破壞金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁的抑制作用相似[29]。結(jié)合共聚焦顯微鏡的觀察結(jié)果，發(fā)現(xiàn)萃取物作用的菌體細(xì)胞紅色熒光強(qiáng)度增大，造成指示菌的細(xì)胞膜損傷，使指示菌細(xì)胞膜形成孔洞，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加，有研究表明，木犀草素可以破壞金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜的完整性[14]。利用花生殼提取物作用于常見的食源性致病菌，高效的控制微生物的生長繁殖。

4 結(jié)論

花生殼提取物對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC 6538具有良好的抑制作用，其中主要抗菌成分在乙酸乙酯萃取部位，能夠?qū)е轮甘揪訙谧冮L，最大比生長速率降低，并且通過破壞指示菌的細(xì)胞壁和增加細(xì)胞膜的通透性，最終表現(xiàn)出抗菌作用。本研究為開發(fā)利用花生殼等其他天然植物提取天然防腐劑提供了參考。