李 燁 ， 張 瑩, ， 高忠燕 ， 張顯光 ， 金振華 ， 王春仁 ， 史同瑞

(1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院 ， 黑龍江 齊齊哈爾 161005 ； 2. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 ， 黑龍江 大慶 163319 ； 3. 扎龍國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局 ， 黑龍江 齊齊哈爾 161002)

丹頂鶴為世界級(jí)瀕危保護(hù)動(dòng)物，是我國的一級(jí)保護(hù)動(dòng)物，野生數(shù)量不足2 500只，主要分布在我國的黑龍江省和東部沿海、朝鮮北部、俄羅斯東部、日本北部等地[1]。丹頂鶴主要食用魚蝦、昆蟲、蛙類等，輔食多為嫩葉、鼠類等。丹頂鶴的飲食習(xí)慣導(dǎo)致其患有魚源性寄生蟲病的風(fēng)險(xiǎn)大大提高。次睪吸蟲的第一中間宿主為紋沼螺，第二中間宿主主要為麥穗魚，據(jù)調(diào)查2019年齊齊哈爾地區(qū)麥穗魚感染東方次睪囊蚴的感染率達(dá)到32.59%[2]。東方次睪吸蟲(Metorchisorientalis)的囊蚴寄生于魚背部肌肉或皮層內(nèi)，丹頂鶴多因食入攜帶囊蚴的麥穗魚而感染。東方次睪吸蟲主要寄生于家禽和野生禽類的膽管和膽囊，偶爾也可以感染犬貓和人，屬于人獸共患寄生蟲[3-5]。病禽通常出現(xiàn)消瘦貧血，食欲不佳和腹瀉等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可以導(dǎo)致死亡。死亡后剖檢，可見膽囊壁增厚，膽囊腫大，膽汁變性，膽道堵塞等病理變化[6]。人體感染后，會(huì)出現(xiàn)腹脹腹痛，肝區(qū)不適等臨床癥狀[7]?？焖贉?zhǔn)確地鑒定寄生蟲種類是對(duì)流行病學(xué)、疾病防控和病原研究等方面的前提。寄生蟲鑒定的傳統(tǒng)方法是基于形態(tài)學(xué)鑒定，目前分子生物技術(shù)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于鑒定寄生蟲種類。核糖體DNA基因(rDNA)內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal transcribed spacer,ITS)的多態(tài)性序列分析(rDNA ITS序列分析)被認(rèn)為是鑒定寄生蟲蟲種的良好基因標(biāo)記，ITS序列可分為ITS1、5.8S rDNA和ITS2，特點(diǎn)是高度保守，進(jìn)化速度快和種內(nèi)差異小[8-10]。因此，本試驗(yàn)對(duì)我國黑龍江省齊齊哈爾扎龍地區(qū)分離的丹頂鶴東方次睪吸蟲進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察與分子生物學(xué)鑒定，并與其他相關(guān)吸蟲ITS序列進(jìn)行了比較與進(jìn)化分析，為丹頂鶴東方次睪吸蟲的種系發(fā)生關(guān)系和鑒別診斷方法的建立提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蟲體 次睪吸蟲采自黑龍江省齊齊哈爾市扎龍地區(qū)自然感染丹頂鶴的膽囊和膽管，經(jīng)生理鹽水沖洗干凈后，于75%乙醇中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑 基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]；TaKaRaExTaq酶、dNTPs、DL-2 000 Marker、pMD-18T載體[寶生物工程(大連)有限公司]；Axygen DNA凝膠回收試劑盒(康寧生命科學(xué)有限公司)；DH5α感受態(tài)細(xì)胞(北京博邁德基因技術(shù)有限公司)。

1.3 主要儀器 PCR儀(型號(hào)為Gene Amp PCR System 9700)，購自Thermo Fisher Scientific公司；電子顯微鏡(型號(hào)為 ECLIPSE E200)，購自NIKON公司；臺(tái)式冷凍型微量離心機(jī)(型號(hào)為D3024R),購自美國塞洛捷克公司。

1.4 形態(tài)學(xué)觀察 選取1條保存于75%乙醇中的吸蟲，放置于載玻片上，蓋上蓋玻片，顯微鏡下進(jìn)行觀察并測(cè)量其大小，參照參考文獻(xiàn)[11]鑒定蟲體。

1.5 總DNA提取 取出5條保存于75%酒精中的東方次睪吸蟲，分別用去離子水反復(fù)沖洗3次。根據(jù)TIANamp Genomic DNA Kit(TIANGEN)說明書提取DNA，提取完畢置于-20 ℃冰箱中保存。

1.6 ITS序列擴(kuò)增 以DNA為模板，參照參考文獻(xiàn)[12]中的NC5和NC2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系(總體積為25 μL)：DNA 1 μL，dNTP 2 μL，10×ExTaqBuffer 2.5 μL，NC2和NC5各0.5 μL，ExTaq0.5 μL，ddH2O 18 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，觀察結(jié)果。參照凝膠回收試劑盒說明書對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化回收后，pMD-18T載體連接PCR產(chǎn)物后轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，12 h后進(jìn)行挑菌和菌液PCR鑒定，陽性菌液使用甘油保存，送至生工生物工程(上海)技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.7 ITS序列的比較分析與進(jìn)化分析 使用DNASTAR 5.0和MEGA 7.0軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析和劃界。用Megalign軟件對(duì)本試驗(yàn)中的東方次睪吸蟲與其他后睪科吸蟲的ITS序列進(jìn)行同源性分析。使用Mega 7.0、Clustal X、Paup 4.0軟件，將本試驗(yàn)的東方次睪吸蟲的ITS2序列與相關(guān)吸蟲序列進(jìn)行比對(duì)，采用最大簡約法(MP)，以日本血吸蟲(Schistosomajaponicum，登錄號(hào)：FJ852573)為外群構(gòu)建進(jìn)化樹，確定本試驗(yàn)中的東方次睪吸蟲在后睪科的系統(tǒng)發(fā)生位置。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察 對(duì)壓片蟲體進(jìn)行觀察。如圖1所示，蟲體呈葉片形，體表有小棘，腹吸盤于體前的1/4處和口吸盤大小相近。咽呈球形，食道短，腸支一直延伸到蟲體末端。睪丸呈分葉狀，子宮回旋兩腸支間，呈管狀，含有大量蟲卵。經(jīng)測(cè)量，體長4.1 mm，體最寬處為1.1 mm。與參考文獻(xiàn)[11]中東方次睪吸蟲形態(tài)學(xué)一致。

圖1 東方次睪吸蟲形態(tài)(標(biāo)尺=1 mm)Fig.1 Morphology of Metorchis orientalis(Bar=1 mm)

2.2 ITS序列擴(kuò)增 本試驗(yàn)擴(kuò)增的5條次睪吸蟲的ITS序列(圖2)，經(jīng)測(cè)序后比對(duì)，獲得5條序列一致的完整ITS序列。ITS序列全長為1 077 bp，其中ITS1、5.8S rDNA和ITS2的長度分別是629、160 bp和288 bp。ITS全序列的A+T含量為46.33%，G+C含量為53.67%，A、T、C、G 堿基的含量分別為17.46%、28.88%、28.23%、25.44%。ITS1序列的A+T含量為45.63%，G+C含量為54.37%，A、T、C、G 堿基的含量分別為17.49%、28.14%、27.34%、27.03%。5.8S rDNA序列A+T含量為45.62%，G+C含量為54.37%，A、T、C、G 堿基的含量分別為20.62%、25.00%、29.38%、25.00%。ITS2序列的A+T含量為48.62%，G+C含量為51.74%，A、T、C、G 堿基的含量分別為15.62%、32.64%、29.51%、22.22%。本試驗(yàn)獲得的ITS序列與之前報(bào)道的東方次睪吸蟲(MK482054)經(jīng)過比對(duì)截齊后，二者的同源性達(dá)到99.8%。與黃體次睪吸蟲(Metorchisxanthosomus)、膽囊次睪吸蟲(Metorchisbilis)和Metorchisussuriensis(暫無中文名)的同源性分別為98.2%、97.6%和98.2%。

圖2 東方次睪吸蟲ITS序列擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 ITS sequence amplification results of Metorchis orientalisM: DL-2 000 Maker; 1～5:東方次睪吸蟲ITS序列M: DL-2 000 Maker; 1-5:ITS sequences of Metorchis orientalis

2.3 系統(tǒng)發(fā)生樹分析 基于ITS2序列構(gòu)建后睪科吸蟲系統(tǒng)發(fā)生樹見圖3，進(jìn)化分析樹自上而下形成3個(gè)大分支。片形科、棘口科、雙腔科、并殖科、同盤科和背孔科吸蟲形成了第1個(gè)大分支；后睪科吸蟲形成了第2個(gè)大分支；前殖科吸蟲形成了第3個(gè)大分支。在第2個(gè)大分支中，本試驗(yàn)的蟲體與東方次睪吸蟲聚集在1個(gè)小分支，表明本試驗(yàn)的次睪吸蟲為東方次睪吸蟲，此結(jié)果與傳統(tǒng)的形態(tài)分類結(jié)果一致。本試驗(yàn)的蟲體與其他次睪屬吸蟲聚集在1個(gè)分支，并與后睪屬吸蟲的分支形成了姐妹支，表明其親緣關(guān)系較近?；谝陨系男螒B(tài)學(xué)與分子生物學(xué)的結(jié)果，鑒定本試驗(yàn)中蟲體為東方次睪吸蟲。

圖3 基于ITS2序列采取MP法構(gòu)建后睪科系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.3 Phylogenetic tree of Opisthorchiidae by MP based on the ITS2 sequences▲：本試驗(yàn)蟲體▲：The isolated worm from this experment

3 討論

次睪吸蟲病由次睪屬吸蟲引起，可以造成畜牧業(yè)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，也是全球的一個(gè)重要公共衛(wèi)生問題[13-14]。目前，次睪屬中已有26種被報(bào)道，其中8種寄生于哺乳動(dòng)物，18種寄生于鳥類[13]。確定次睪吸蟲的物種分類和進(jìn)化大多基于成蟲的形態(tài)[11]，基于形態(tài)學(xué)去鑒定并不能很準(zhǔn)確定種，尤其在其他發(fā)育階段的時(shí)候。rDNA序列具有高度保守性和進(jìn)化時(shí)鐘性，目前已被廣泛地應(yīng)用到物種進(jìn)化和分類中，尤其是其中的ITS序列已經(jīng)廣泛用作種間的分類，解決了長期存在的寄生蟲物種分類爭議。李喬等[15](2020年)對(duì)野馬體內(nèi)線蟲進(jìn)行ITS序列擴(kuò)增，通過結(jié)果鑒定其為馬副蛔蟲和鼻狀杯環(huán)線蟲。Na等[16](2016年)對(duì)東方次睪吸蟲的線粒體基因組進(jìn)行了擴(kuò)增和進(jìn)化分析，結(jié)果顯示次睪屬與后睪屬形成了姐妹分支，與本試驗(yàn)的結(jié)果一致。通過本試驗(yàn)中的進(jìn)化分析，東方次睪吸蟲與其他次睪屬吸蟲處于1個(gè)小分支中，與傳統(tǒng)的自然分類結(jié)果一致，綜上說明ITS序列可以作為研究物種親緣關(guān)系的基因標(biāo)記。本試驗(yàn)對(duì)我國黑龍江省齊齊哈爾市扎龍地區(qū)丹頂鶴體內(nèi)分離的次睪吸蟲進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定，確定丹頂鶴源的次睪吸蟲為東方次睪吸蟲，此結(jié)果為次睪吸蟲的分子鑒別診斷和進(jìn)化分析提供了科學(xué)依據(jù)。