張開亮，韓 康，張 勇，陳 明，關(guān)國鋒

(1.解放軍第960醫(yī)院泰安醫(yī)療區(qū)，山東 泰安 271000；2.解放軍第960醫(yī)院濟(jì)南醫(yī)療區(qū)，山東 濟(jì)南 250000；3.解放軍聯(lián)勤保障部隊北戴河康復(fù)療養(yǎng)中心，山東 秦皇島 066100；4.空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院骨科，陜西 西安 710038；5.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院足踝外科，山東 濱州 256600)

骨肉瘤是常見的原發(fā)性骨惡性腫瘤[1]。然而，令人遺憾的是，骨肉瘤的治療在近幾十年來并未取得明顯進(jìn)展。其治療方案目前包括新輔助化療、手術(shù)治療和術(shù)后化療，患者5年生存率仍只有60%左右[2]。發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者預(yù)后更差[3]。因此，急需尋找新的治療方案或靶點(diǎn)來提高骨肉瘤患者的預(yù)后。研究[3-5]表明，異常表達(dá)的環(huán)狀RNA(Circular RNA，circRNA)存在于多種腫瘤中，這意味著circRNA在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中可能扮演重要角色，有可能成為腫瘤治療的靶點(diǎn)和診斷指標(biāo)。此外，多個異常表達(dá)的circRNA參與骨肉瘤的增殖、侵襲和遷移等生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)[6-7]。hsa_circ_103809作為circRNA家族中的一員，已被證實(shí)可促進(jìn)乳腺癌、肝細(xì)胞癌、肺癌、胃癌和膀胱癌等多種腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲或遷移，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[8-12]。但其在骨肉瘤中是否同樣具有促進(jìn)作用，尚未見報道。本研究觀察hsa_circ_103809對骨肉瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移等生物學(xué)行為的影響，分析其表達(dá)水平與骨肉瘤臨床參數(shù)的相關(guān)性，期望明確其在骨肉瘤中的作用，同時為骨肉瘤的臨床治療提供新的思路和靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集 40例骨肉瘤臨床組織標(biāo)本以及10例相應(yīng)骨肉瘤瘤旁組織于2016年3月至2018年12月采集于唐都醫(yī)院骨科。所有病例在標(biāo)本采集前均未進(jìn)行過放化療，且標(biāo)本采集前均取得患者同意并簽署同意書。標(biāo)本采集后立刻放入液氮罐保存。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人成骨細(xì)胞系hFOB1.19及人骨肉瘤細(xì)胞系MG63、Saos-2和143B均保存于唐都醫(yī)院骨科全軍骨腫瘤研究所。hFOB1.19細(xì)胞采用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。MG63和Saos-2細(xì)胞采用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。143B細(xì)胞采用含有10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。所有細(xì)胞均在含有5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 hsa_circ_103809 siRNA及其陰性對照(NC)序列(批號：R10043.8；廣州銳博生物科技有限公司)的瞬時轉(zhuǎn)染均采用Lipofectamine2000TM(批號：11668019；美國Invitrogen公司)進(jìn)行。待6孔板內(nèi)細(xì)胞匯合度為40%～50%時，采用100 nmol/L濃度進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染hsa_circ_103809 siRNA，對照組轉(zhuǎn)染siRNA NC。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞進(jìn)行CCK-8和Transwell實(shí)驗(yàn)。

1.4 熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測 細(xì)胞及組織內(nèi)RNA均采用TRIzol試劑(批號：T9424；美國Sigma公司)進(jìn)行提取。提取RNA后，采用PrimeScript RT Reagent Kit(批號：RR037A；日本Takara公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。然后采用SYBR Premix Ex Taq(批號：RR420A；日本Takara公司)進(jìn)行qRT-PCR檢測。hsa_circ_103809正向引物序列為5’-ACGCATTCTTCGAGACCTCT-3’，反向引物序列為5’-TGC-CTGTAACTCCTCTTCAGT-3’。GAPDH正向引物序列為5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，反向引物序列為5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。相對表達(dá)量的計算以GAPDH為參照，采用2-△△CT方法進(jìn)行。

1.5 CCK-8增殖實(shí)驗(yàn) 收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，以3000細(xì)胞/孔鋪于96孔板，每組采用6復(fù)孔，共鋪24、48、72、96 h四塊板，每24 h取一塊板，每孔加入10 μl CCK-8溶液(批號：CK04；日本同仁)。在細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h后檢測波長450 nm處的光密度(OD)值，然后繪制生長曲線。

1.6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 將Matrigel基質(zhì)膠(批號：35623；美國BD公司)采用Opti-MEM(批號：31985070；美國Gibco公司)培養(yǎng)基以1∶8進(jìn)行稀釋，然后取50 μl鋪于小室內(nèi)并置于培養(yǎng)箱1 h后使其凝固。收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，采用相應(yīng)無血清培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，計數(shù)后取5×104細(xì)胞添加至每小室上室，下室添加含有20%胎牛血清的相應(yīng)培養(yǎng)基。18 h后取出小室，用95%乙醇固定，再用0.5%結(jié)晶紫溶液染色，通過樹脂封片后進(jìn)行觀察計數(shù)。

1.7 Transwell遷移實(shí)驗(yàn) 上室不鋪基質(zhì)膠，經(jīng)過12 h后取出小室，后續(xù)處理同1.6。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，采用Graphpad Prism 7.0軟件作圖。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用雙因素方差分析，hsa_circ_103809表達(dá)水平與骨肉瘤臨床參數(shù)的相關(guān)性分析采用Fisher確切概率法進(jìn)行，骨肉瘤及瘤旁組織hsa_circ_103809表達(dá)水平比較采用配對t檢驗(yàn)，其余實(shí)驗(yàn)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。若P<0.05，則認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 骨肉瘤組織與瘤旁組織、骨肉瘤細(xì)胞系與成骨細(xì)胞系hsa_circ_103809表達(dá)水平比較 見圖1。相對于瘤旁組織，骨肉瘤組織中hsa_circ_103809的表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)。此外，骨肉瘤細(xì)胞系hsa_circ_103809的表達(dá)水平均明顯高于成骨細(xì)胞系hFOB1.19(均P<0.05)。以上結(jié)果提示，骨肉瘤組織和細(xì)胞系中上調(diào)的hsa_circ_103809可能起到促進(jìn)骨肉瘤進(jìn)展的作用。

注：A圖中，與瘤旁組織比較，**P<0.01；B圖中，與成骨細(xì)胞系hFOB1.19比較，*P<0.05，***P<0.001

2.2 兩組細(xì)胞hsa_circ_103809表達(dá)水平比較 見圖2。qRT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siRNA 24 h以后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中hsa_circ_103809的表達(dá)水平較對照組明顯降低(P<0.01)。此結(jié)果提示，采用siRNA抑制hsa_circ_103809的表達(dá)有效，其可被用于后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)的研究。

注：與對照組比較，**P<0.01

2.3 兩組細(xì)胞增殖能力比較 見圖3。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在24、48 h的OD值與對照組比較沒有統(tǒng)計學(xué)差異，而在72、96 h的OD值均較對照組明顯降低(均P<0.01)，表明實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在72、96 h的增殖能力較對照組明顯減弱。此結(jié)果提示，hsa_circ_103809可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖。

注：與相同時間點(diǎn)對照組比較，**P<0.01，***P<0.001

2.4 兩組細(xì)胞侵襲能力比較 見圖4。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯低于對照組(P<0.01)，表明實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞侵襲能力明顯低于對照組。此結(jié)果提示，hsa_circ_103809可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的侵襲。

注：A圖為兩組細(xì)胞Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)代表圖(結(jié)晶紫染色，×200)；B圖中，與對照組相比，**P<0.01

2.5 兩組細(xì)胞遷移能力比較 見圖5。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移能力較對照組明顯減弱(P<0.01)。此結(jié)果提示，hsa_circ_103809可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的遷移。

注：A圖為兩組細(xì)胞Transwell遷移實(shí)驗(yàn)代表圖(結(jié)晶紫染色，×200)；B圖中，與對照組相比，**P<0.01

2.6 hsa_circ_103809表達(dá)水平與骨肉瘤患者臨床參數(shù)相關(guān)性分析 見表1。在對臨床骨肉瘤組織標(biāo)本進(jìn)行hsa_circ_103809表達(dá)水平的檢測后，以所有樣本的平均值為基準(zhǔn)，將高于平均值的分為hsa_circ_103809高表達(dá)組，反之為hsa_circ_103809低表達(dá)組。然后對兩組患者性別、年齡、腫瘤大小、臨床分期及轉(zhuǎn)移與否等臨床參數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示hsa_circ_103809表達(dá)水平與骨肉瘤患者臨床分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均呈正相關(guān)(均P<0.05)，提示hsa_circ_103809在骨肉瘤的臨床中作為癌基因，可促進(jìn)骨肉瘤進(jìn)展。

表1 hsa_circ_103809表達(dá)水平與骨肉瘤患者臨床參數(shù)相關(guān)性分析(例)

3 討 論

作為青少年常見的原發(fā)性骨惡性腫瘤之一，骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制在近年來已得到廣泛的研究[13-15]。特別是隨著RNA測序技術(shù)的發(fā)展，大量非編碼RNA被證實(shí)參與骨肉瘤的調(diào)控。在非編碼RNA領(lǐng)域，隨著circRNA成為現(xiàn)在的研究熱點(diǎn)，一些circRNA已被證實(shí)參與骨肉瘤的進(jìn)展，可作為骨肉瘤潛在診治靶點(diǎn)。例如，骨肉瘤中高表達(dá)hsa_circ_001621可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移[16]。同樣，hsa_circ_001105在骨肉瘤中的表達(dá)被下調(diào)，而低表達(dá)的hsa_circ_001105被證實(shí)可抑制骨肉瘤的轉(zhuǎn)移[17]。

本研究中發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_103809在骨肉瘤細(xì)胞和組織中表達(dá)水平均上調(diào)。為進(jìn)一步明確高表達(dá)的hsa_circ_103809是否可促進(jìn)骨肉瘤進(jìn)展，我們采用了siRNA沉默技術(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在同一細(xì)胞系中對實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞采用siRNA沉默技術(shù)來下調(diào)hsa_circ_103809的表達(dá)，然后將實(shí)驗(yàn)組的增殖、侵襲和遷移等功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果與對照組進(jìn)行比較，從而最終在細(xì)胞層面明確了hsa_circ_103809可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。同時，為明確其在骨肉瘤細(xì)胞系中作用的普遍性，我們選擇了骨肉瘤143B和Saos-2兩個細(xì)胞系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，后續(xù)仍可進(jìn)一步在骨肉瘤其他多個細(xì)胞系中進(jìn)行驗(yàn)證。在本研究中，我們最終在細(xì)胞層面證實(shí)了hsa_circ_103809可作為癌基因促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。研究結(jié)果同之前hsa_circ_103809在乳腺癌、胃癌等多種腫瘤中的作用相一致[8-12]，表明hsa_circ_103809在多種腫瘤中均起到癌基因作用。

除了在細(xì)胞層面，我們也在臨床組織標(biāo)本中進(jìn)行了hsa_circ_103809的檢測，并根據(jù)表達(dá)水平將標(biāo)本分成hsa_circ_103809高表達(dá)組和低表達(dá)組，結(jié)果證實(shí)hsa_circ_103809表達(dá)水平與骨肉瘤臨床分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。臨床標(biāo)本層面的研究結(jié)果同細(xì)胞層面相一致，都表明hsa_circ_103809在骨肉瘤中起到促進(jìn)作用。

研究表明，circRNA可通過海綿吸附miRNA，進(jìn)而解除miRNA對下游mRNA的抑制作用。例如，高表達(dá)的circ_ARF3通過海綿吸附miR-1299，進(jìn)而消除后者對于CDK6的下調(diào)，從而促進(jìn)骨肉瘤的進(jìn)展[18]；circ_PVT1通過海綿吸附miR-526b解除miR-526b對FOXC2的抑制作用，從而促進(jìn)骨肉瘤轉(zhuǎn)移[19]。就hsa_circ_103809而言，其已被證實(shí)可通過海綿吸附miR-516a-5p、miR-101-3p、miR-377-3p和miR-4302等miRNA，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌、胃癌和肝細(xì)胞癌等腫瘤的進(jìn)展[8-12]。但在骨肉瘤中hsa_circ_103809是否可作用于以上靶基因，還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，我們在細(xì)胞和臨床標(biāo)本層面證實(shí)了hsa_circ_103809在骨肉瘤中的促進(jìn)作用，為后續(xù)全面地進(jìn)行hsa_circ_103809在骨肉瘤中的研究打下了堅實(shí)的基礎(chǔ)，也為骨肉瘤的臨床治療提供了新的思路和靶點(diǎn)。但因?yàn)楣侨饬鲚^其他腫瘤發(fā)病率低，使得大規(guī)模獲取臨床標(biāo)本比較困難，因此本研究樣本量比較小，后續(xù)還需要多中心大樣本量進(jìn)行更廣泛的研究，進(jìn)一步確定hsa_circ_103809在臨床實(shí)踐中的癌基因作用，也需要完善動物實(shí)驗(yàn)以及尋找hsa_circ_103809具體的下游作用通路，以更加全面地證實(shí)hsa_circ_103809在骨肉瘤中的癌基因作用。