王雪嬌，蘇二虎，李 強 *，趙曉宇 ，陳 強，賈利敏 ，王新華

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031；2.杭錦后旗農(nóng)牧業(yè)技術推廣中心，內(nèi)蒙古杭錦后旗 015400）

DNA 分子標記是以個體間核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，它是生物個體在DNA 水平上遺傳變異的直接反映。目前，許多分子標記技術被應用于作物種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析、QTL 定位及分子標記輔助育種等方面，但它們大多屬于隨機DNA 分子標記，所得位點通常與目的基因距離較遠、目標性較差。CDDP 標記就是一種新型目的基因標記技術，其引物來自于 WRKY、MYB、ERF、KNOX、MADS 及ABP 等轉錄因子基因家族，涉及到植物生長發(fā)育、抗病、代謝等多個性狀。Poczai 等[1]利用CDDP 與ITM（intron-targeting markers）相結合的方法分析了歐白英的遺傳多樣性，標記多態(tài)性條帶百分率為90%；李瑩瑩等[2]利用CDDP 標記研究了菏澤牡丹的遺傳多樣性，標記多態(tài)性比率高達95.58%；Li 等[3]對菊花進行了CDDP 遺傳多樣性研究，多態(tài)性比率也高達92.53%，可有效地揭示菊花品種間的親緣關系；17條引物共擴增出120 個DNA 條帶，多態(tài)性條帶百分率為68.33%，平均多態(tài)性信息含量為0.644，在引物多態(tài)性方面較以上研究略低，可能是由于物種間基因組差異較大造成的。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取151 份國內(nèi)外不同地理來源的大豆代表性品種。國內(nèi)品種主要來源于黑龍江（42 個）、吉林（40個）、內(nèi)蒙古（15 個）、遼寧（9 個），其他省區(qū) 13 個，國外品種32 個。

1.2 DNA 的提取

采用天根公司植物基因組DNA 提取試劑盒提取151 份大豆材料總DNA。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測其質(zhì)量及完整性，根據(jù)檢測結果，將總DNA 稀釋為20 ng/μL 的工作液，置于-20℃冰箱中備用。

1.3 CDDP 引物及PCR 反應體系

21 條 CDDP 引物來自 Collard 等[4]文獻報道，均由上海生工生物工程有限公司合成。CDDP-PCR 反應體系為20 μL，包括Taq 聚合酶用量1.5 U、Mg2+濃度 2.0 mmol/L、引物濃度 0.375 μmol/L、dNTPs 濃度 0.3 mmol/L、DNA 模板用量 40 ng。PCR 反應程序為：94℃預變性 3 min；94℃變性 50 s，48.5℃～52.5℃退火 1 min，72℃延伸 2 min，35 個循環(huán)；最后 72℃延伸 8 min，4℃保溫[5]。

1.4 電泳及檢測

取 10 μL 擴增產(chǎn)物，加入 2 μL 6×loading buffer，在1.5%瓊脂糖凝膠（含核酸染料）中電泳，以D2000 Marker 作標準分子質(zhì)量進行對照，在SN-NJ0601凝膠成像系統(tǒng)觀察記錄并采集圖像。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Gel-Pro analyzer 凝膠圖像分析軟件并結合人工識別的方法，對清晰穩(wěn)定的主帶進行統(tǒng)計，在相同遷移位置上有帶賦值為“1”，無帶賦值為“0”，建立原始數(shù)據(jù)矩陣。

用Excel 2003 計算總條帶數(shù)、多態(tài)性條帶數(shù)、多態(tài)性條帶百分率及多態(tài)性信息含量。應用Popgene1.32 軟件計算有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei’s 基因多樣性指數(shù)（H）、香農(nóng)信息指數(shù)（I）、不同群體間的 Nei’s遺傳一致度和遺傳距離等，并根據(jù)Nei’s 遺傳一致度采用非加權成對算術平均法（UPGMA）在Ntsys-pcVer.2.10軟件中繪制群體間聚類關系圖。應用POWERMARKER Version 3.25 軟件根據(jù) Nei’s（1983）遺傳距離，繪制個體間聚類圖。

2 結果與分析

2.1 CDDP 引物的篩選及多態(tài)性分析

采用優(yōu)化好的大豆CDDP-PCR 反應體系及24個差異明顯的大豆品種，從21 條引物中篩選出17條譜帶清晰、穩(wěn)定且多態(tài)性好的引物對151 份大豆種質(zhì)資源進行多態(tài)性擴增（圖1），共產(chǎn)生120 個條帶，其中，多態(tài)性條帶82 個，多態(tài)性條帶百分率為68.33%（表1）。每條引物的多態(tài)性變幅為33.33%～92.31%，每條引物檢測的位點數(shù)為3～13 個，平均位點數(shù)為7.06 個，平均多態(tài)性位點4.82 個；不同引物擴增出的總條帶數(shù)、多態(tài)性條帶數(shù)差異較大，多態(tài)性條帶數(shù)最多的是引物MADS-2，為12 條，多態(tài)性條帶百分率為92.31%；多態(tài)性條帶數(shù)和多態(tài)性條帶百分率最低的是引物WRKY-R1，分別為1 條和33.33%，其他引物多態(tài)性條帶百分率均高于50%。17 條引物多態(tài)性信息含量（PIC） 的變異范圍為0.289～0.948，平均為 0.644，表明 CDDP 標記能較好地反映151 份大豆品種的遺傳多樣性。

圖1 引物Myb2 對24 個大豆品種的擴增結果

表1 17 條CDDP 引物對151 個大豆種質(zhì)的擴增結果及多態(tài)性

2.2 不同地理來源大豆品種的遺傳多樣性分析

由表2 可知，大豆品種群水平上的遺傳多樣性均高于6 個地理來源群體的平均水平。品種群水平上的有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei’s 基因多樣性指數(shù)（H）和香農(nóng)信息指數(shù)（I）分別為 1.740 7、0.414 2 和0.601 2；不同地理來源群體水平上的指標Ne、H、I 分別為1.684 0、0.386 2 和0.565 1。6 個不同地理來源大豆品種的 Ne 變異在 1.637 3～1.738 8；H 是衡量供試品種間遺傳多樣性最常用的指標，能夠反映物種等位基因的豐富度和均勻程度，其變異范圍為0.360 2～0.406 3；I 變異范圍為 0.527 9～0.586 1；Ne、H、I 指標均表現(xiàn)為其他省區(qū)＞國外＞吉林＞遼寧＞黑龍江＞內(nèi)蒙古，均以其他省區(qū)最高，內(nèi)蒙古最低。綜合比較分析各項遺傳多樣性參數(shù)可以看出，內(nèi)蒙古和黑龍江大豆品種的遺傳多樣性較低，國外品種和其他省區(qū)大豆具有較高的遺傳多樣性水平。

2.3 不同地理來源大豆品種群的遺傳一致度和聚類分析

從表3 可以看出，6 個大豆地理來源群間的遺傳一致度變化范圍為0.858 0（國外和其他省區(qū)）～0.965 7（內(nèi)蒙古和黑龍江），平均為0.920 4；群體間遺傳距離變化范圍為0.034 9（內(nèi)蒙古和黑龍江）～0.150 1（國外和其他省區(qū)），這表明內(nèi)蒙古和黑龍江的大豆品種遺傳關系很近，國外品種與國內(nèi)品種遺傳關系較遠，特別是與其他省區(qū)類群品種遺傳關系最遠。

為了進一步揭示不同地理來源大豆群體的分化趨勢與親緣關系，根據(jù)大豆品種群間的 Nei’s 遺傳一致度，進行UPGMA 聚類分析。從圖2 可以看出，遺傳相似系數(shù)在 0.882 處，6 個品種群可以分為兩大類，即國內(nèi)品種和國外品種，表明參試國內(nèi)外大豆品種間的親緣關系較遠。進一步細分，國內(nèi)群在遺傳相似系數(shù)為0.922 處又可分為3 個亞類，即：黑龍江、內(nèi)蒙古、吉林品種聚為一類，遼寧、其他省區(qū)品種各為一類。聚類結果與地理分布有一定的相關性。

表2 不同地理來源群體遺傳多樣性分析

表3 基于CDDP 標記的不同地理來源大豆種質(zhì)群的遺傳一致度和遺傳距離

2.4 參試大豆種質(zhì)聚類分析

由圖3 可知，供試材料被分為三大類。第Ⅰ類群共3 份材料，占供試材料的2.0%，包括黑龍江的地方品種壓破車、吉林的吉農(nóng)12 和其他省區(qū)的中黃13。第Ⅱ類群包括65 份材料，占供試材料的43.0%，該類群又可進一步細分為4 個亞類，其中，第1 亞類有10 份材料，包括其他省區(qū)品種6 份，占60.0%，遼寧品種3 份，國外品種1 份，多數(shù)為晚熟品種；第2亞類有20 份材料，包括吉林品種16 個，占80.0%，黑龍江、遼寧、內(nèi)蒙古和新疆品種各1 份，其中，新疆的石大豆1 號為引進的吉林品種；第3 亞類有26 份材料，包括吉林和黑龍江品種各10 個，2 個地區(qū)品種占76.9%，內(nèi)蒙古品種3 個，遼寧品種2 個，國外品種1 個；第4 亞類有9 份材料，包括黑龍江品種6個，占66.7%，吉林品種2 個及新疆品種1 個。第Ⅲ類群共83 份材料，占供試材料的55.0%，該類群又可細分為3 個亞類，其中，第1 亞類有5 份材料，包括吉林品種3 個，內(nèi)蒙古和遼寧品種各1 個；第2 亞類有28 份材料，包括黑龍江品種17 個，占60.7%，吉林品種4 個，國外、內(nèi)蒙古、其他省區(qū)品種各2 個，遼寧品種1 個；第3 亞類有50 份材料，包括國外品種28 個，占該亞群的56.0%，占國外全部供試材料的87.5%，另外，還有內(nèi)蒙古品種8 個，占內(nèi)蒙古全部供試材料的57.1%，黑龍江品種7 個，吉林品種4個，其他省區(qū)品種2 個，遼寧品種1 個。

圖2 基于CDDP 標記的6 個不同地理來源群體UPGMA聚類關系

圖3 151 份大豆種質(zhì)UPGMA 聚類結果

由圖3 可以進一步看出，國內(nèi)外品種基本可以分開，國外品種87%以上聚在一起，第Ⅲ類群第3 亞類中28 個國外品種聚在一起；來源相同地區(qū)的品種有聚成一類的現(xiàn)象，特別是來自相同育種單位的品種大多都聚在了一起，如合豐50 和合豐47、黑農(nóng)56和黑農(nóng)53、吉育57 和吉育67、通農(nóng)11 和通農(nóng)14 等聚在了一起；另外發(fā)現(xiàn)，內(nèi)蒙古與黑龍江品種親緣關系較近，第Ⅱ類群中內(nèi)蒙古的蒙豆9 號、蒙豆30 號、登科1 號與黑龍江的紫花2 號、黑河38、墾豐20、合豐55 等聚在了一起，原因是它們含有一些共同的親本，血緣比較近；黑龍江與吉林的種質(zhì)資源交流較多，因此在不同類群中都有聚在一起的現(xiàn)象，如第Ⅰ類群中的黑龍江的壓破車與吉林的吉農(nóng)12，第Ⅱ類群的牡豐1 號與黃寶珠、黑農(nóng)44 與吉育72，第Ⅲ類群中的青豆與小金黃等都聚在一起，而白城秣食豆、薄地高、茶色豆、小金黃、青豆等地方品種大多聚為一類。

3 討論與結論

該研究聚類分析發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)外大豆品種基本可以分開，遺傳差異較大，關榮霞等[6]通過對中國32 個品種與40 份國外種質(zhì)的聚類分析發(fā)現(xiàn)美國種質(zhì)可以和中國大豆育成品種區(qū)分開來，且國外種質(zhì)具有更多的特有等位變異，說明中外大豆品種具有較大的遺傳差異；魏崍等[7]也認為中國和美國大豆遺傳距離較大，存在較大的遺傳差異，美國大豆資源可以用來豐富中國大豆的遺傳基礎，這些結果與該研究結果一致。另外，該研究還發(fā)現(xiàn)地理來源相同的品種有聚在一起的趨勢，特別是相同育種單位的大豆品種聚在一起，這與張軍等[8]的研究結果一致，可能因為相同地區(qū)大豆育種者都使用了少數(shù)幾個優(yōu)良骨干親本，而且世代材料選擇經(jīng)驗相似，種植的地理生態(tài)環(huán)境相同等，導致了育成品種間親緣關系比較近。

CDDP 分子標記技術多態(tài)性水平較高，信息含量豐富，可有效揭示大豆種質(zhì)資源的遺傳多樣性。聚類分析結果表明，國外與國內(nèi)大豆品種遺傳距離較遠，地方品種與育成品種遺傳差異較大，可利用國外品種和地方品種拓寬我國大豆的遺傳基礎。該研究結果可為大豆種質(zhì)資源科學評價和利用提供理論依據(jù)和參考。