（海南省藥物研究所，海南 ?？?570311）

前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9）基因是 2003年被發(fā)現(xiàn)的一個(gè)脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)蛋白[1]，它是哺乳動(dòng)物前蛋白轉(zhuǎn)化酶家族的第九個(gè)成員，其結(jié)構(gòu)組成包括信號(hào)肽、前結(jié)構(gòu)域、催化結(jié)構(gòu)域和 C-末端結(jié)構(gòu)域[2]。PCSK9基因在肝臟、小腸及腎臟等組織中均有表達(dá)，它在膽固醇和脂質(zhì)代謝過(guò)程中具有非常重要的作用[3]。研究表明，PCSK9基因參與脂質(zhì)代謝主要是通過(guò)促進(jìn)肝細(xì)胞的低密度脂蛋白受體 (low density lipoproteinreceptor，LDLR)的降解[4]，使血液中低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）的水平上升[5]，從而引起高膽固醇血癥的發(fā)生[6-9]。因此，PCSK9是人類高膽固醇血癥的主要致病基因之一[10]。

PCSK9基因已經(jīng)成為治療高膽固醇血癥的潛在靶點(diǎn)。PCSK9抑制劑可通過(guò)抑制或降低PCSK9基因，阻斷PCSK9介導(dǎo)的LDLR降解，上調(diào)細(xì)胞表面 LDLR，從而下調(diào)LDL-C的水平，有效治療高膽固醇血癥，減少心血管疾病的發(fā)生。因此，通過(guò)繁育獲得足夠數(shù)量的PCSK9基因工程小鼠疾病模型，對(duì)于開(kāi)展高膽固醇血癥等心血管疾病的研究與治療具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

野生型C57BL/6小鼠和PCSK9基因工程小鼠均飼養(yǎng)于海南省藥物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房中。

1.2 主要試劑與儀器

酚，氯仿，無(wú)水乙醇，Triton X-100，蛋白酶K，Trizma Hydrochloride Solution，2×Taq Master Mix（Dye Plus），瓊脂糖，DNA Marker，0.5×TBE 緩沖液，基因組DNA提取試劑盒。

電子分析天平，電熱恒溫水箱，PCR儀，低溫高速離心機(jī)，電泳儀，凝膠成像系統(tǒng)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 PCSK9基因工程小鼠的飼養(yǎng)與繁殖。小鼠飼養(yǎng)于海南省藥物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)屏障環(huán)境中，飼養(yǎng)溫度為 22～26 °C，相對(duì)濕度為 50%～70%，人為控制晝夜明暗交替，自由飲水和采食。飼料為Co60輻照飼料，墊料為玉米芯顆粒，飲用水經(jīng)凈水器過(guò)濾處理并高壓滅菌。每天進(jìn)入動(dòng)物房觀察小鼠生長(zhǎng)情況，添加飼料并更換飲水。隔天更換墊料。

初期采用基因工程小鼠的雜合子首建鼠與野生型小鼠長(zhǎng)期合籠的方式進(jìn)行繁殖，對(duì)子代小鼠通過(guò)PCR和測(cè)序進(jìn)行基因型鑒定，對(duì)鑒定為陽(yáng)性的小鼠采用雌雄1∶1的比例合籠，通過(guò)繁育獲得穩(wěn)定遺傳的子代小鼠。子鼠出生3周后斷奶分籠飼養(yǎng)。

1.3.2 小鼠的基因型鑒定。鼠基因組DNA的提取。小鼠出生后7 d左右對(duì)其進(jìn)行剪趾編號(hào)，剪取2～5 mm小鼠尾組織置于1.5 mL EP管中，加入300 μL含有Triton X-100和蛋白酶K的鼠尾裂解液，56°C裂解過(guò)夜。將300 μL酚氯仿顛倒混勻，12 000 rpm離心10 min，吸取上清液至新的EP管中。加入2倍體積的無(wú)水乙醇，顛倒混勻。4°C條件下，12000 rpm離心 5 min，棄去上清液。加入500 μL 70%的乙醇，洗滌 2次。4℃條件下，12000 rpm離心5min。棄去上清液并在超凈工作臺(tái)中干燥，加入預(yù)熱的ddH2O溶解即得到基因組DNA。

采用PCR反應(yīng)和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行基因型鑒定。以基因組DNA作為模板，用于PCR擴(kuò)增。上游引物為 5′-TATGTCCATGTATTCTGACAGGCT-3′， 下游引 物 為 5′-AGCTGTTGACACTCAGAAAAGCAA-3′。PCR反應(yīng)采用25 uL體系進(jìn)行擴(kuò)增，按照試劑盒說(shuō)明書上的加樣體系和PCR擴(kuò)增程序進(jìn)行，采用6×loading buffer終止反應(yīng)，并利用2%瓊脂糖凝膠電泳的方法鑒定PCR反應(yīng)產(chǎn)物。小鼠尾部組織瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示為在551 bp處有一條帶的即鑒定為陽(yáng)性。

通過(guò)測(cè)序進(jìn)行基因型鑒定。對(duì)PCR檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的個(gè)體進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，并根據(jù)測(cè)序結(jié)果選擇陽(yáng)性個(gè)體開(kāi)展后續(xù)繁育。

2 結(jié)果

2.1 小鼠基因型鑒定結(jié)果

PCR擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 小鼠PCR鑒定結(jié)果

經(jīng)過(guò) PCR 擴(kuò)增， 1、2、6、8、18、23、27、29、30 共 9個(gè)個(gè)體可以擴(kuò)增出551bp的目的條帶，鑒定結(jié)果為陽(yáng)性。PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的個(gè)體的測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

測(cè)序結(jié)果顯示，1、2、6、8、18、23、27、29、30 號(hào)個(gè)體缺失13202bp。

3 討論

由于基因工程小鼠數(shù)量較少，在傳代過(guò)程中可能造成基因的丟失或改變，因此在飼養(yǎng)繁育方面，其要求更高一些。要嚴(yán)格控制晝夜明暗交替的時(shí)間，同時(shí)對(duì)飼料、墊料、飲水等所有物品都必須嚴(yán)格消毒。處于哺乳期的雌性小鼠對(duì)外界環(huán)境的刺激比較敏感，光線和噪音等因素都可能導(dǎo)致其神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，進(jìn)而出現(xiàn)食仔的現(xiàn)象。所以在繁育期間要盡可能地減少外界刺激，除了換水加料、更換籠具，盡量不要打擾繁育期的雌鼠?？梢悦恐芑Q雄鼠，這樣能夠增加雌鼠懷孕的幾率。對(duì)鑒定為非轉(zhuǎn)基因的仔鼠要及時(shí)淘汰，而對(duì)一些比較珍貴的基因工程小鼠可以采取保存冷凍精液和胚胎的方式進(jìn)行保種。

PCR鑒定是利用基因工程小鼠基因組與野生型小鼠基因組的序列差異，以小鼠基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR，并根據(jù)凝膠電泳的條帶不同來(lái)區(qū)分不同的基因型。所提取的基因組DNA的濃度及PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)條件等都可能會(huì)影響PCR的結(jié)果。對(duì)于PCR結(jié)果為陽(yáng)性的小鼠，可以進(jìn)一步進(jìn)行測(cè)序鑒定，對(duì)測(cè)序結(jié)果為陽(yáng)性的個(gè)體可以根據(jù)需要進(jìn)行留種繼續(xù)繁育，或者用于后續(xù)的試驗(yàn)研究。