（巴彥淖爾市磴口縣人民政府辦公室，內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015200）

近年來瘤胃酸中毒引起的瘤胃損傷逐漸成為研究熱點(diǎn)，最新研究表明，急性和亞急性瘤胃酸中毒不僅影響了瘤胃上皮的組織形態(tài)，而且損害了瘤胃上皮的屏障功能（Steel et al，2009，2011）[1-5]。 針對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞增殖與凋亡在瘤胃黏膜屏障功能中的作用也少見報(bào)道，本文建立SARA奶山羊模型，通過對(duì)瘤胃黏膜上皮細(xì)胞增殖、凋亡情況的改變進(jìn)行研究，以探討SARA在瘤胃黏膜屏障功能中的可能意義及其機(jī)制。

1 試驗(yàn)

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取9只健康處于泌乳期的奶山羊?yàn)樵囼?yàn)動(dòng)物，按體重、泌乳量相近原則隨機(jī)分為：對(duì)照組 （n＝3）、SARA 組（n＝3）和 SARA 恢復(fù)組（n＝3）。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧（NFC/NDF＝1.02）；SARA組通過飼喂非纖維性碳水化合物與中性洗滌纖維比 （NFC/NDF）為1.02、1.24、1.63和2.58的日糧誘導(dǎo)奶山羊發(fā)生SARA；恢復(fù)組：前期飼喂方法與SARA組相同，待SARA誘導(dǎo)成功后讓奶山羊自由采食青干草4周，使試驗(yàn)?zāi)躺窖蛑饾u恢復(fù)。整個(gè)試驗(yàn)期，試驗(yàn)動(dòng)物采用單籠飼養(yǎng)，每天07:00和19:00兩次等量飼喂，自由飲水。

試驗(yàn)飼糧參照NRC（1981）奶山羊營(yíng)養(yǎng)需求配制，試驗(yàn)飼糧組成與營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗(yàn)日糧的組成及營(yíng)養(yǎng)水平

1.2 檢測(cè)指標(biāo)

1.2.1 瘤胃黏膜的取材與處理。對(duì)照組、SARA組和恢復(fù)組奶山羊宰殺前禁食12 h，宰殺后立即取瘤胃后背盲囊、后腹盲囊、前腹盲囊、前背盲囊及瓣胃組織塊，去肌層，剔除結(jié)締組織，去掉內(nèi)容物后用無菌生理鹽水反復(fù)沖洗干凈，然后用吸水紙吸干組織塊表面水分，用載玻片刮取各部位黏膜并立即置于凍存管中，標(biāo)記后置于-80℃冰箱中保存待用；取上述組織塊（1 mm3）置于4%戊二醛溶液中固定，用于電鏡的觀察；取組織塊（1 cm×1 cm×1 cm）若干放于 10%的福爾馬林中固定，進(jìn)行PCNA和TUNEL的檢測(cè)。

1.2.2 透射電鏡的觀察。取瘤胃后背盲囊、后腹盲囊、前腹盲囊、前背盲囊及瓣胃組織塊（1 mm3）置于4%戊二醛溶液中固定，用于電鏡切片的制作，分別觀察對(duì)照組、SARA組及恢復(fù)組各組瘤胃上皮細(xì)胞細(xì)胞器的變化情況及是否有凋亡小體的形成。

1.2.3 黏膜生化數(shù)據(jù)測(cè)定。以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)，參照 Lowry法[6]測(cè)定黏膜蛋白質(zhì)含量；DNA和RNA含量測(cè)定采用二苯胺法[7]，以小牛胸腺 DNA作為標(biāo)準(zhǔn)。RNA含量通過測(cè)定332 nm和260 nm處的吸光值，用 Fleck-Begg[8]公式算出。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色標(biāo)記上皮細(xì)胞PCNA。采用En-vosion法免疫組織化學(xué)染色標(biāo)記PCNA、PCNA一抗（購(gòu)于abcam公司抗體）。參照許岸高等[9]的標(biāo)準(zhǔn)每張切片在普通光學(xué)顯微鏡下連續(xù)觀察至少5個(gè)以上高倍視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞核著棕褐色即為陽性染色細(xì)胞。隨機(jī)計(jì)數(shù)每個(gè)瘤胃乳頭上皮黏膜陽性細(xì)胞及細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算陽性染色細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)，即細(xì)胞增殖指數(shù)（%）=陽性細(xì)胞數(shù)／總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.5 TUNEL檢測(cè)上皮細(xì)胞凋亡。參考Gabriel等方法，應(yīng)用 TUNEL試劑盒（批號(hào) 122010，Roche公司），結(jié)合說明書的方法，稍有改動(dòng)。每張切片在普通光學(xué)顯微鏡下連續(xù)觀察至少5個(gè)以上高倍視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，凋亡細(xì)胞即為細(xì)胞核中出現(xiàn)棕褐色顆粒或者細(xì)胞核質(zhì)呈均勻的棕黃色，隨機(jī)計(jì)數(shù)每個(gè)瘤胃乳頭上皮總數(shù)及瓣胃黏膜陽性細(xì)胞及細(xì)胞總數(shù)，即凋亡指數(shù)（%）=陽性細(xì)胞數(shù)／總細(xì)胞數(shù)×100%。

2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示，采用SAS 9.0統(tǒng)計(jì)軟件中的ANOVA對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，用Duncan法進(jìn)行多重比較，P＜0.05為差異顯著，P＞0.05為差異不顯著。

3 結(jié)果

3.1 SARA對(duì)瘤胃黏膜形態(tài)的影響

由圖1可以看出，對(duì)照組瘤胃上皮細(xì)胞微絨毛較整齊，細(xì)胞核較大，部分核染色質(zhì)均勻，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)未見異常。SARA組上皮細(xì)胞微絨毛排列不整齊，線粒體腫脹、峭斷裂，核固縮，核形不規(guī)則，核膜表面凸凹不平，染色質(zhì)邊集化，細(xì)胞核裂碎，胞漿濃縮，可見凋亡小體形成。

圖1 瘤胃上皮透射電鏡圖

3.2 SARA對(duì)瘤胃黏膜蛋白質(zhì)、DNA和RNA的影響

由表2可以看出，SARA組瘤胃黏膜上皮蛋白質(zhì)顯著低于對(duì)照組和恢復(fù)組（P＜0.05），恢復(fù)組顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。DNA含量SARA組和恢復(fù)組顯著低于對(duì)照組，SARA組和恢復(fù)組相比差異不顯著 （P＞0.05）。RNA含量SARA組低于對(duì)照組和恢復(fù)組 （P＞0.05），3組間差異均顯著 （P＜0.05）。與對(duì)照組相比，SARA組和恢復(fù)組瘤胃黏膜蛋白質(zhì)含量分別下降了44%（P＜0.05）和 20%（P＜0.05），DNA 含量分別下降了51%和 44%，RNA含量分別下降了 94%和 58%；SARA組與恢復(fù)組相比，SARA組蛋白質(zhì)、DNA和RNA含量分別下降了30%、13%和88% ?；謴?fù)組瘤胃黏膜上皮RNA/DNA最高，SARA組最低，3組間差異均不顯著（P＞0.05）。

表2 SARA對(duì)瘤胃黏膜蛋白質(zhì)、DNA和RNA含量的影響 (mg/g)

3.3 SARA對(duì)瘤胃黏膜上皮細(xì)胞增殖的影響

PCNA陽性細(xì)胞染色呈棕黃色，如圖2所示。由表3可以看出，SARA組瘤胃PCNA陽性細(xì)胞數(shù)為（35.00±12.03），比對(duì)照組（64.67±8.29）明顯高，恢復(fù)組PCNA陽性細(xì)胞數(shù)為（50.33±7.58），高于對(duì)照組且低于SARA組，SARA組與對(duì)照組及恢復(fù)組相比差異顯著 (P＜0.05)，而恢復(fù)組與對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05）。

圖2 瘤胃上皮PCNA表達(dá)圖（x200）

表3 SARA對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞PCNA表達(dá)的影響（%）

3.4 SARA對(duì)瘤胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡的影響

凋亡細(xì)胞的核經(jīng)TUNEL染色呈棕褐色，正常細(xì)胞核呈綠色如圖3所示。由圖3和表4可以看出，SARA組瘤胃凋亡陽性細(xì)胞數(shù)為（62.5±8.38），比對(duì)照組（14.5±2.43）明顯高，恢復(fù)組凋亡陽性細(xì)胞數(shù)為（42.0±10.92），高于對(duì)照組且低于SARA組，差異均顯著(P＜0.05)。

圖3 TUNEL法檢測(cè)瘤胃上皮細(xì)胞凋亡圖（x200）

表4 SARA對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞凋亡的影響（%）

3.5 SARA對(duì)瘤胃和瓣胃上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)與增殖指數(shù)比值(AI/PI)的影響

由表5可以看出，SARA組瘤胃上皮細(xì)胞凋亡率與增殖比值（1.78±0.21）與對(duì)照組（0.23±0.01）相比明顯升高，恢復(fù)組為 （0.87±0.05），高于對(duì)照組且低于SARA 組，3 組差異均顯著（P＜0.05），而對(duì)照組、SARA組及恢復(fù)組上皮細(xì)胞凋亡率與增殖比值分別為0.14±0.02、1.45±0.44、1.11±0.32，SARA 組 與 對(duì) 照 組 相比差異顯著(P＜0.05)，而與恢復(fù)組相比差異不顯著（P＞0.05）。

表5 SARA對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞凋亡率與增殖比值的影響（%）

4 討論

4.1 SARA對(duì)瘤胃黏膜形態(tài)及蛋白質(zhì)、DNA、RNA含量的影響

本試驗(yàn)通過測(cè)定瘤胃黏膜蛋白質(zhì)、DNA和RNA含量來揭示瘤胃上皮細(xì)胞的增殖情況。由表1可知，3組瘤胃黏膜RNA/DNA由高到低依次是對(duì)照組、恢復(fù)組及SARA組，而RNA/DNA值更確切地反映蛋白質(zhì)合成情況。本試驗(yàn)表明，對(duì)照組瘤胃黏膜蛋白質(zhì)合成強(qiáng)于恢復(fù)組，而SARA組最弱，這與直接測(cè)定蛋白質(zhì)含量結(jié)果相一致。DNA含量能夠間接地反映細(xì)胞增殖情況，本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃黏膜DNA含量對(duì)照組顯著高于恢復(fù)組（P＜0.05）,而恢復(fù)組顯著低于SARA組（P＜0.05），說明對(duì)照組瘤胃細(xì)胞增殖量高于恢復(fù)組和SARA組，SARA組最次。

目前，研究者普遍認(rèn)為丁酸能夠促進(jìn)瘤胃上皮細(xì)胞的增殖。Sakata[10]研究認(rèn)為，瘤胃快速灌注丁酸后，瘤胃上皮細(xì)胞指數(shù)分裂提高，并認(rèn)為丁酸能夠刺激瘤胃上皮細(xì)胞進(jìn)行分裂，最終引起增殖。黃智南[11]再次證明，高營(yíng)養(yǎng)日糧對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3個(gè)試驗(yàn)組的奶山羊飼喂不同飼料，隨著NFC/NDF比增加，SARA組瘤胃丁酸濃度增加，并且高于對(duì)照組和恢復(fù)組。SARA丁酸濃度最高，其細(xì)胞增殖反而弱于對(duì)照組和恢復(fù)組，這與黃智南（2010）瘤胃灌注丁酸，瘤胃上皮細(xì)胞有增殖趨勢(shì)相反。之所以出現(xiàn)截然不同的結(jié)果，可能與SARA模型建立方式不同，也可能是處于SARA階段的奶山羊瘤胃內(nèi)丁酸濃度過高，超出瘤胃對(duì)丁酸的代謝作用，最終丁酸對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞的增殖有抑制作用，但最主要的是SARA對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞有損害作用?；謴?fù)組奶山羊在發(fā)生SARA后飼喂青干草，瘤胃上皮增殖能力反而強(qiáng)于SARA組，但是與對(duì)照組相比較弱些，這可能是瘤胃丁酸濃度降低，或者是粗飼料能刺激瘤胃上皮細(xì)胞發(fā)育的原因。

4.2 SARA對(duì)瘤胃黏膜上皮細(xì)胞增殖與凋亡的影響

瘤胃上皮細(xì)胞凋亡率受日糧NFC/NDF比影響，處于SARA階段的奶山羊瘤胃上皮細(xì)胞凋亡較對(duì)照組明顯增加，凋亡指數(shù)較對(duì)照組及恢復(fù)組存在顯著性差異（P＜0.05），說明SARA時(shí)瘤胃上皮細(xì)胞發(fā)生過度性凋亡。瘤胃上皮發(fā)生過度性凋亡，導(dǎo)致瘤胃黏膜屏障遭到損傷，尤其是機(jī)械屏障。瘤胃角質(zhì)層構(gòu)成了黏膜的機(jī)械屏障，與胃內(nèi)容物直接接觸，因而受到損傷的幾率最大。同時(shí)，當(dāng)SARA發(fā)生時(shí)，瘤胃內(nèi)VFA大量積累導(dǎo)致pH值升高，瘤胃處于異常應(yīng)激狀態(tài)，造成瘤胃黏膜破損、出血及潰瘍[12]，從而導(dǎo)致上皮細(xì)胞凋亡進(jìn)一步增加，胃黏膜的通透性增強(qiáng)，引起屏障功能減弱，大量?jī)?nèi)毒素及細(xì)菌由瘤胃壁進(jìn)入血液循環(huán)造成內(nèi)毒素血癥[13]，進(jìn)一步破壞瘤胃壁，加重了SARA的發(fā)展[14]。因而本試驗(yàn)可以推測(cè)SARA能促進(jìn)瘤胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡的發(fā)生，是導(dǎo)致瘤胃黏膜屏障功能障礙的一個(gè)重要因素。

瘤胃上皮細(xì)胞PCNA增殖指數(shù)受日糧NFC/NDF比影響，SARA組瘤胃上皮細(xì)胞PCNA增殖指數(shù)明顯減少，與對(duì)照組相比差異顯著 （P＜0.05），說明發(fā)生SARA時(shí)瘤胃上皮細(xì)胞PCNA表達(dá)減少，提示SARA對(duì)瘤胃黏膜細(xì)胞的增殖有抑制作用，不利于黏膜的損傷修復(fù)?；謴?fù)組PCNA增殖指數(shù)低于對(duì)照組，但明顯高于SARA組，恢復(fù)組與對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05）。說明恢復(fù)組的恢復(fù)情況好于SARA組，但不及對(duì)照組。

本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，SARA組瘤胃上皮細(xì)胞AI/PI明顯高于對(duì)照組，恢復(fù)組AI/PI值高于對(duì)照組且低于SARA組。說明奶山羊在發(fā)生SARA后停止誘導(dǎo)其中毒，再次給予青干草可以緩解SARA癥狀，但是恢復(fù)不到對(duì)照組狀態(tài)。因此，從AI/PI角度考慮，SARA對(duì)奶山羊瘤胃上皮細(xì)胞的凋亡有促進(jìn)作用，對(duì)增殖有抑制作用。

綜上所述，處于SARA階段奶山羊瘤胃上皮細(xì)胞凋亡率明顯要高于對(duì)照組和恢復(fù)組，而細(xì)胞PCNA表達(dá)與凋亡率呈現(xiàn)相反結(jié)果，即SARA組低于對(duì)照組和恢復(fù)組，恢復(fù)組高于SARA而低于對(duì)照組。上皮細(xì)胞的凋亡與增殖的相對(duì)平衡是維持屏障完整性的保障，因此，SARA對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞增殖受抑制而凋亡起到促進(jìn)作用，黏膜屏障遭到嚴(yán)重破壞，進(jìn)而加重SARA的發(fā)生。

5 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，SARA組瘤胃黏膜蛋白質(zhì)、DNA及RNA含量與對(duì)照組和恢復(fù)組相比，均呈現(xiàn)偏低趨勢(shì)。說明SARA的發(fā)生降低了瘤胃黏膜蛋白質(zhì)、DNA及RNA的含量。SARA對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞的凋亡有促進(jìn)作用，但是對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞增殖活性有抑制作用。