朱敏，李君

(上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院手術(shù)室，上海 200000)

高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)是導(dǎo)致宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)及宮頸癌發(fā)生的必要條件，但并非唯一致病因素[1]。HR-HPV感染后引發(fā)的宮頸病變與機體免疫功能，尤其是宮頸局部微環(huán)境的免疫功能關(guān)系密切[2]。機體的免疫調(diào)控機制復(fù)雜多樣，外來抗原HR-HPV、機體免疫細胞及局部微環(huán)境之間相互調(diào)節(jié)、相互制約，免疫抑制微環(huán)境借助免疫耐受、免疫逃逸等機制可促進CIN等宮頸病變的發(fā)生、發(fā)展[3]。外周血T淋巴細胞亞群作為機體免疫調(diào)控機制中的重要一環(huán)，具有介導(dǎo)細胞免疫反應(yīng)、維持機體內(nèi)環(huán)境平衡及殺傷腫瘤細胞等作用[4]。調(diào)節(jié)性T淋巴細胞是一類具有免疫抑制功能的輔助性T淋巴細胞亞群，可通過抑制多種免疫細胞活化而對機體及宮頸局部的免疫機制造成影響[5]。本研究通過對CIN合并HR-HPV感染患者的外周血T淋巴細胞亞群、調(diào)節(jié)性T細胞進行檢測，旨在探討其與CIN病變、HR-HPV感染的聯(lián)系和發(fā)展趨勢，進而為CIN合并HR-HPV感染病情的預(yù)測評估、臨床診治提供可靠依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年7月至2019年5月上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院收治的192例CIN合并HR-HPV感染患者作為研究對象，其中CINⅠ級57例，CINⅡ級71例，CIN Ⅲ級64例。本研究獲得我院倫理委員會批準，并與參與者簽訂知情同意書。納入標準：(1)經(jīng)宮頸組織病理學檢查明確為CIN，符合《宮頸癌及癌前病變病理診斷規(guī)范》[6]中關(guān)于CIN的相關(guān)診斷標準；(2)HR-HPV DNA水平均>103 copies/mL；(3)年齡18～75歲，均為已婚婦女；(4)對本研究知情并簽署同意書。排除標準：(1)合并感染性疾病、其他類型惡性腫瘤或自身免疫性疾病者；(2)入院前3個月內(nèi)有免疫抑制劑、皮質(zhì)類固醇激素使用史者；(3)既往有放療、化療等抗腫瘤治療史者；(4)人類免疫缺陷(HIV)陽性；(5)妊娠期或哺乳期婦女；(6)心、肝、腎等重要臟器有嚴重器質(zhì)性病變者；(7)存在認知功能障礙或精神疾病者。

1.2 方法

1.2.1 HPV DNA載量檢測 在無菌環(huán)境下將宮頸刷置于宮頸內(nèi)旋轉(zhuǎn)3周后停留片刻取出，將宮頸刷置于無菌試管中采集宮頸內(nèi)外脫落的細胞，之后將收集的脫落細胞及時進行HR-HPV檢測。DNA提取和PCR擴增標準嚴格按照說明書(PCR熒光法)進行操作，檢測儀器為DA7600型PCR擴增儀，PCR擴增儀以及HR-HPV核酸定量檢測試劑盒(包括16、18、31、33、45、52、56、58，共計8個型)均購自中山大學達安基因股份有限公司。按照HR-HPV核酸定量檢測的拷貝數(shù)分為低載量組(104～105copies/mL)、中載量組(105～106copies/mL)、高載量組(106～107copies/mL)、超高載量組(>107copies/mL)。

1.2.2 外周血T淋巴細胞亞群及調(diào)節(jié)T細胞檢測 所有患者在入院后采集清晨空腹靜脈血10 mL，保存于-80 ℃的低溫環(huán)境下保存待測。血液樣本經(jīng)肝素鈉抗凝處理后分別加入5 mL流式管底以及CD3、CD4、CD8，各10 μL，混合均勻后靜置于室溫避光環(huán)境中，20 min后加入紅細胞裂解液再靜置10 min，離心10 min(1 500 rpm)后取上清液，加入2 mL PBS洗液進行離心沖洗，最后采用0.5 mL PBS緩沖液進行緩沖。采用美國BD公司的FACS CantoⅡ型流式細胞儀檢測對細胞懸液中CD3+、CD4+和CD8+亞群的數(shù)目及比例進行測定，并按照上述方法對外周血CD4+CD25+CD127-水平進行測定。檢測所用試劑盒均購自德國Partec公司。

1.3 觀察指標

比較不同CIN級別患者的HPV DNA載量水平及分布情況，同時對不同CIN級別以及不同HPV DNA載量CIN患者的外周血T淋巴細胞亞群(包括CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)以及調(diào)節(jié)性T細胞(CD8+、CD4+CD25+CD127-)水平進行對比分析。對CIN級別、HPV DNA載量與T淋巴細胞亞群、調(diào)節(jié)性T細胞進行Pearson相關(guān)性分析。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 不同CIN級別患者HPV DNA載量水平及分布

CIN級別越高，HPV DNA載量越高，不同CIN級別患者HPV DNA載量水平及分布存在顯著差異(P<0.05)。見表1。

2.2 不同CIN級別患者外周血T淋巴細胞亞群及調(diào)節(jié)性T細胞檢測結(jié)果

CIN級別越高，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平越低，CD8+、CD4+CD25+CD127-水平越高，不同CIN級別患者在外周血T淋巴細胞亞群及調(diào)節(jié)性T細胞水平上比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

2.3 不同HPVDNA載量CIN患者的T淋巴細胞亞群及調(diào)節(jié)性T細胞檢測結(jié)果

HPVDNA載量水平越高，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平越低，CD8+、CD4+CD25+CD127-水平越高，不同HPVDNA載量CIN患者的T淋巴細胞亞群及調(diào)節(jié)性T細胞水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

2.4 CIN級別、HPVDNA載量與T淋巴細胞亞群、調(diào)節(jié)性T細胞的相關(guān)性分析

Pearson分析結(jié)果顯示，CIN級別、HPVDNA載量與CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平呈現(xiàn)負相關(guān)(P<0.05)，與CD8+、CD4+CD25+CD127-水平呈現(xiàn)正相關(guān)(P<0.05)。見表4。

表1不同CIN級別患者的HPVDNA載量水平及分布

CIN級別HPV DNA載量水平(log10copies/mL)HR-HPV載量分布[n(%)]低載量中載量高載量超高載量CINⅠ級(n=57)5.43±0.5121(36.84)15(26.32)14(24.56)7(12.28)CINⅡ級(n=71)6.17±0.67?17(23.94)19(26.76)21(29.58)14(19.72)CINⅢ級(n=64)7.48±0.82?#11(17.19)13(20.31)17(26.56)23(35.94)F/χ2值141.1913.526P值<0.0010.035

表2 不同CIN級別患者的外周血T淋巴細胞亞群及調(diào)節(jié)性T細胞檢測結(jié)果比較

表3 不同HPVDNA載量CIN患者的T淋巴細胞亞群及調(diào)節(jié)性T細胞比較

表4 CIN級別、HPVDNA載量與T淋巴細胞亞群、調(diào)節(jié)性T細胞的相關(guān)性分析

3 討論

CIN主要是指子宮頸上皮非典型性增生至原位癌的一系列癌前病變，CIN的發(fā)生、發(fā)展主要由HR-HPV持續(xù)感染和宮頸局部免疫微環(huán)境改變的協(xié)同疊加作用導(dǎo)致，HR-HPV感染是CIN發(fā)生的最主要危險因素[7-10]。本研究對不同CIN級別患者PV DNA載量水平及分布進行對比發(fā)現(xiàn)，CIN級別越高的患者，其HPV DNA載量水平越高，不同CIN級別患者的HPV DNA載量水平及分布存在顯著差異。上述結(jié)果表明，CIN病變的嚴重程度與HPV感染密切相關(guān)。

外周T淋巴細胞亞群是宮頸局部細胞免疫的主要效應(yīng)細胞，參與T細胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫應(yīng)答的亞群主要是CD4+和CD8+。CD4+主要負責抗原傳遞，能夠在B細胞的協(xié)助下分化，產(chǎn)生抗體，在免疫應(yīng)答中處于主導(dǎo)地位[11]。CD8+屬于抑制性T細胞和細胞毒性T細胞，在免疫應(yīng)答中能夠發(fā)揮免疫抑制作用。CD4+、CD8+細胞互相誘導(dǎo)、制約對于調(diào)控機體免疫功能、維持局部免疫環(huán)境穩(wěn)定意義重大[12-13]。調(diào)節(jié)性T細胞是一類在胸腺中成熟、經(jīng)外圍誘導(dǎo)后形成的幼稚T淋巴細胞，具有促進多種抑制性細胞因子分泌的作用。通過下調(diào)CD4+、CD8+細胞增殖反應(yīng)，負向調(diào)控NK細胞的免疫效應(yīng)等途徑，調(diào)節(jié)性T細胞能夠使腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視，發(fā)生免疫逃逸[14]。

本研究結(jié)果顯示CIN級別越高，HPV DNA載量水平越高的患者，其CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平越低，CD8+、CD4+CD25+CD127-水平越高。不同CIN級別、不同HPV DNA載量水平患者在外周血T淋巴細胞亞群及調(diào)節(jié)性T細胞水平上存在顯著差異。上述結(jié)果提示，隨著CIN病變、HR-HPV感染程度的逐漸加重，患者免疫功能下降愈加明顯，外周血T淋巴細胞亞群及調(diào)節(jié)性T細胞均存在異常表達，且外周血T淋巴細胞亞群及調(diào)節(jié)性T細胞的異常表達隨著病情的發(fā)展逐漸加劇[15-16]。分析原因，外周T淋巴細胞亞群在正常生理狀況下維持相對穩(wěn)定，CIN病變、HR-HPV感染會導(dǎo)致患者免疫功能受損，進而使外周T淋巴細胞群及調(diào)節(jié)性T細胞出現(xiàn)異常表達，進一步發(fā)展可導(dǎo)致機體免疫系統(tǒng)失衡，最終誘發(fā)宮頸癌的發(fā)生[17]。

Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)CIN級別、HPV DNA載量與CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平呈現(xiàn)負相關(guān)(P<0.05)，與CD8+、CD4+CD25+CD127-水平呈現(xiàn)正相關(guān)。結(jié)果提示外周T淋巴細胞亞群與調(diào)節(jié)性T細胞與CIN病變及HR-HPV感染密切相關(guān)，二者在宮頸病變中可能存在相互作用，其作用機制可能在機體內(nèi)通過抑制自身同源性腫瘤的細胞免疫途徑而促使CIN病變的發(fā)生[18-19]，臨床上檢測其水平有利于評估CIN病變嚴重程度及HR-HPV感染程度。

綜上所述，HR-HPV感染是CIN、宮頸癌等宮頸病變的重要危險因素，外周血T淋巴細胞亞群、調(diào)節(jié)性T細胞參與了CIN、HR-HPV感染的發(fā)生、發(fā)展過程，通過檢測外周血T淋巴細胞亞群、調(diào)節(jié)性T細胞表達能夠為CIN及宮頸癌的早期篩查、輔助診斷、病情監(jiān)測及免疫治療提供可靠依據(jù)。