王鵬，王遵義，邵建強(qiáng)，張勤，張輝

(滄州市中心醫(yī)院甲狀腺乳腺外三科，河北 滄州 061000)

乳腺癌是婦女最為常見的惡性腫瘤之一，且發(fā)病率逐漸上升，大部分死亡均因癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移所引起，其中最主要的轉(zhuǎn)移方式為淋巴道轉(zhuǎn)移，故而對(duì)乳腺癌患者的淋巴道轉(zhuǎn)移進(jìn)行控制可以有效降低乳腺癌致死率[1-2]。Rho蛋白是一種小分子蛋白，具有一定程度的酶活性，在細(xì)胞增殖和分裂過程中有重要的生物學(xué)作用，一般通過下游靶效應(yīng)對(duì)細(xì)胞骨架活動(dòng)進(jìn)行調(diào)節(jié)，對(duì)細(xì)胞變形轉(zhuǎn)移具有重要開關(guān)作用[3-4]。研究[5]顯示，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與Rho蛋白存在一定相關(guān)性，主要包括新生血管形成、轉(zhuǎn)移和侵襲細(xì)胞凋亡以及腫瘤增殖和生長(zhǎng)等。RhoA作為Rho家族蛋白一員，在多種腫瘤組織高水平表達(dá)，并與腫瘤惡性程度關(guān)系密切，在腫瘤轉(zhuǎn)移及發(fā)生中起著重要的作用[6]。本研究探討RhoA在乳腺癌中的表達(dá)及與淋巴管生成、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，分析其潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇滄州市中心醫(yī)院2016年3月至2019年12月收治的140例乳腺癌患者和70例纖維瘤患者作為研究對(duì)象，收集其手術(shù)切除石蠟標(biāo)本，其中乳腺癌患者年齡(47.85±3.21)歲。按照臨床分期[7]為Ⅰ期46例、Ⅱ期62例、Ⅲ期20例和Ⅳ期12例。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)執(zhí)行，所有患者均同意并簽署知情協(xié)議書。納入標(biāo)準(zhǔn)：其中乳腺癌組患者均經(jīng)病理學(xué)檢驗(yàn)明確診斷者，且排除合并嚴(yán)重心肝腎功能障礙者，所有患者及家屬同意并簽署知情協(xié)議書者；乳腺纖維瘤符合乳腺纖維腺瘤診治專家共識(shí)[8]中的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除妊娠哺乳期患者，合并心肝腎功能障礙者；排除凝血功能障礙者；依從性差，中途退出者。

1.2 儀器和試劑

電熱恒溫水浴箱(北京市醫(yī)療設(shè)備廠)、烘片機(jī)、石蠟切片機(jī)、漂烘處理儀、包埋機(jī)以及脫水機(jī)(德國(guó)LEICA)，顯微鏡(OLYMPUS)。氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(貨號(hào)SK2020)均購(gòu)于上?？祈樕锟萍加邢薰?，濃縮型抗人RhoA單克隆抗體(貨號(hào)TL-102)購(gòu)于北京科昕生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 資料收集 收集乳腺癌患者年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER、PR、HER-2、臨床分期等相關(guān)資料。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色 采用S-P法對(duì)患者標(biāo)本RhoA表達(dá)情況進(jìn)行測(cè)定[9]，采用常規(guī)的脫蠟和水化操作對(duì)石蠟切片進(jìn)行處理，之后通過pH6.0的高壓檸檬酸鹽緩沖液對(duì)其抗原進(jìn)行修復(fù)處理。將下邊同業(yè)進(jìn)行依次滴加處理，具體如下：過氧化酶阻斷液、非免疫性動(dòng)物血清，分別在室溫條件下孵育10 min，100 mL的第一抗體(堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠一抗)，之后室溫條件下孵育60 min，第二抗體(辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗)、鏈菌素抗生素-過氧化物酶溶液，分別在室溫條件下孵育10 min，最后將DAB顯色劑(新鮮配置)滴加其中，顯色5 min。并在顯微鏡下進(jìn)行染色觀察。通過自來水進(jìn)行沖洗、蘇木素進(jìn)行復(fù)染、脫水和透明處理，并進(jìn)行中性樹膠封片處理。

1.3.3 判斷結(jié)果 采用改良后的Tanaka定量計(jì)分法進(jìn)行結(jié)果判定[10]，采用具有代表性的5個(gè)視野區(qū)域，在200倍鏡下進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞的計(jì)數(shù)和顯色強(qiáng)度判定，其中陽(yáng)性細(xì)胞百分率不小于75%為4分，50%～75%為3分，25%～50%為2分，5%～5%為1分，陽(yáng)性細(xì)胞百分率不超過5%，為0分。顯色強(qiáng)度棕褐色為3分，棕黃色為2分，淺黃色為1分，未著色為0分，兩項(xiàng)相乘，即可得計(jì)算平均值。按照得分情況將其分為4個(gè)等級(jí)，其中>9分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)、5～8分為中度陽(yáng)性(++)、2～4分為弱陽(yáng)性(+)、0～1分為陰性(-)，其中>1分可判定為陽(yáng)性，≤1分判定為陰性。

1.3.4 淋巴管的判定和計(jì)數(shù)方法 參考Weidner推薦的方法對(duì)其淋巴管計(jì)數(shù)和判定進(jìn)行分析[11]，被染成棕黃色的內(nèi)皮細(xì)胞簇或者單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞連成的不閉合或者閉合的線狀管腔，即可作為一個(gè)可以計(jì)數(shù)的微淋巴管，被確定的首先要在200倍顯微鏡下進(jìn)行微淋巴管密度(LMVD)最高區(qū)域的選擇，之后再在200倍顯微鏡下選擇5個(gè)顯微視野，淋巴管密度(LVD)值即為計(jì)數(shù)平均值/鏡下面積(0.74 mm2)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 RhoA的表達(dá)分布及LVD值水平分析

纖維瘤標(biāo)本陰性表達(dá)，見圖1。乳腺癌患者RhoA陽(yáng)性表達(dá)，見圖2。乳腺癌患者RhoA表達(dá)的陽(yáng)性率和LVD值均高于纖維瘤患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 RhoA的表達(dá)分布及LVD值水平分析

2.2 乳腺癌組織中的LVD與RhoA表達(dá)的相關(guān)性

經(jīng)Spearman相關(guān)性分析顯示，乳腺癌組織中的LVD與RhoA表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)(r=0.315，P=0.004)。

2.3 乳腺癌組織中的RhoA表達(dá)與其臨床病理參數(shù)的關(guān)系

乳腺癌組織中的RhoA表達(dá)與其年齡、腫瘤大小、孕激素受體(PR)、雌激素受體(ER)以及HER-2無相關(guān)性，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(r=0.783，P<0.001)和臨床分期(r=0.654，P<0.001)呈現(xiàn)正相關(guān)。見表2。

表2 乳腺癌組織中的RhoA表達(dá)與其臨床病理參數(shù)的關(guān)系[n(%)]

3 討論

Rho蛋白家族是一種具有細(xì)胞內(nèi)分子開關(guān)功能的GTP酶[10-12]，可以在細(xì)胞外信號(hào)的強(qiáng)烈刺激下，與鳥苷酸結(jié)合并水解，使其在失活性(結(jié)合GDP)與活性型(結(jié)合GTP)之間循環(huán)[13]。而對(duì)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)是Rho蛋白家族的重要功能，另外，在調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡及惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移或浸潤(rùn)等方面起著較為重要的作用[14]。Rho蛋白通過改變細(xì)胞骨架組裝，調(diào)控細(xì)胞遷移，進(jìn)而影響腫瘤轉(zhuǎn)移的整個(gè)過程[15]。研究[11]顯示，RhoA蛋白是Rho蛋白家族成員之一，與腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移關(guān)系密切。Arnold等[16]研究顯示，與正常組織相比，結(jié)腸癌、乳腺癌及肺癌組織中RhoA蛋白的表達(dá)率相對(duì)較高。Wang等[17]認(rèn)為，消化道腫瘤中RhoA蛋白的表達(dá)率明顯較高。

微血管密度是評(píng)估血管生成的“金標(biāo)準(zhǔn)”，即對(duì)新生血管數(shù)目采用免疫組化法進(jìn)行檢測(cè)[18]。而本文將LVD作為評(píng)估淋巴管生成的重要指標(biāo)。文中結(jié)果顯示，乳腺癌組織中存在一定量的新生淋巴管，而新生淋巴管的內(nèi)皮存在相對(duì)較大的間隙，同時(shí)周圍的足細(xì)胞也相對(duì)較少；且與纖維瘤相比，乳腺癌組織中的LVD值較高[19]。這表明新生淋巴管對(duì)乳腺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)的生成具有重要作用，而淋巴管數(shù)目的增加也提高了腫瘤細(xì)胞向管腔進(jìn)入的風(fēng)險(xiǎn)[20]。 文中相關(guān)性結(jié)果提示RhoA蛋白的表達(dá)對(duì)腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移和淋巴管新生具有一定的促進(jìn)作用。研究[21-22]顯示，RhoA蛋白的高水平表達(dá)還可一定程度刺激VEGF在腫瘤細(xì)胞株中的表達(dá)上調(diào)，對(duì)淋巴管新生的誘導(dǎo)效果還可被可溶性的VEGFR-3所阻斷，故而RhoA蛋白還可能通過對(duì)VEGF和VEGFR-3進(jìn)行調(diào)節(jié)，進(jìn)而間接性的促進(jìn)淋巴管的生成。另外，與Ⅰ-Ⅱ期乳腺癌患者相比，Ⅲ-Ⅳ期患者的RhoA蛋白陽(yáng)性表達(dá)率更高，表明其與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展以及轉(zhuǎn)移關(guān)系較為密切。

綜上所述，乳腺癌中RhoA蛋白的表達(dá)可以促進(jìn)乳腺癌淋巴管的新生，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期以及LVD值均呈正相關(guān)，可為乳腺癌淋巴道的轉(zhuǎn)移抑制提供新的研究方向，具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。