岳岑

(廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，福建 廈門 361000)

急性腦缺血發(fā)生時(shí)，外周血中相關(guān)分子參與了腦卒中的病理生理過程[1]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的局部損傷會(huì)誘導(dǎo)血源性炎癥細(xì)胞激活，產(chǎn)生并釋放促炎因子和趨化因子。激活的白細(xì)胞浸潤缺血的大腦，加重炎癥程度，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[2-3]。但缺血性腦卒中如何改變外周血的急性免疫反應(yīng)，并導(dǎo)致腦損傷的分子機(jī)制仍未完全了解。多項(xiàng)微陣列研究[4-5]發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中外周血存在明顯的基因組改變，外周血基因組分析有利于了解腦卒中病理生理過程的分子機(jī)制。MicroRNAs(miRNAs)是基因表達(dá)的主要內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子，與其靶基因的3’端非編碼區(qū)結(jié)合(3’-UTR)，從而抑制或激活靶基因表達(dá)[6-7]。目前，已超過2 000種人類miRNAs被鑒定，約有30%的基因可能受到miRNAs的調(diào)控[8]。研究[9-10]表明，miRNAs在腦缺血事件中，特別是再灌注階段在大腦和外周血均有明顯變化，如miR-186-5p、miR-19a-3p、miR-32-5p、miR-30a-5p、miR-579-3p等在急性腦卒中中存在異常表達(dá)。本研究根據(jù)文獻(xiàn)和相關(guān)數(shù)據(jù)庫初步篩選8個(gè)候選miRNAs[9-10]，采用RT-qPCR進(jìn)一步驗(yàn)證其在急性腦卒中患者中的表達(dá)情況及其對(duì)靶基因的調(diào)控作用，望為了解腦損傷的分子機(jī)制提供新的參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究方案經(jīng)廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者或監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。選取2017年3月至2020年3月廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院收治的急性缺血性腦卒中患者60例為病例組。其中，男性34例，女性26例；平均年齡(61.53±6.71)歲；入院時(shí)NIHSS評(píng)分中位數(shù)為2分；病因包括大動(dòng)脈粥樣硬化性腦卒中(LAA)、小動(dòng)脈閉塞性腦梗死或腔隙性腦梗死(SAO)、心源性腦栓塞(CE)等；TOAST分型中，LAA 18例、SAO 30例、CE并SAO 12例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合全國腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議制定的急性缺血性腦卒中診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]；(2)患者均為首次發(fā)病，并于發(fā)病24 h內(nèi)入院；(3)經(jīng)頭顱CT/MRI確診為腦梗死。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)腦出血或顱內(nèi)出血，短暫性腦缺血發(fā)作；(2)腫瘤患者；(3)嚴(yán)重肝腎系統(tǒng)疾病者；(4)合并感染、免疫類疾病者。另選取60名同期體檢健康者作為對(duì)照組，其中男性31例，女性29例；平均年齡(60.56±5.87)歲；既往無神經(jīng)系統(tǒng)疾病史、腫瘤病史、嚴(yán)重肝腎系統(tǒng)疾病及感染或免疫類等疾病。病例組和對(duì)照組性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、受教育年限、吸煙、飲酒情況等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而高血壓、高血脂和冠心病差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR檢測miRNAs的表達(dá)水平 (1)miRNAs的篩選：根據(jù)文獻(xiàn)和相關(guān)數(shù)據(jù)庫初步篩選出8個(gè)候選miRNAs，分別為miR-186-5p、miR-19a-3p、miR-32-5p、miR-30a-5p、miR-579-3p、Let-7e、miR-362-3p、miR-1238-5p。(2)外周血采集和提取總RNA：抽取病例組在入院24 h內(nèi)靜脈血5 mL，取樣時(shí)間為癥狀出現(xiàn)后13.5 h，IQR (10～18.0 h)；對(duì)照組抽取體檢當(dāng)天靜脈血5 mL。樣本置于EDTA抗凝管中，立于冰上30 min后，吸出上清。10 000 g離心5 min，棄沉淀。取上清保存于-80 ℃冰箱備用。miRcute血清/血漿miRNA提取分離試劑盒(DP503，天根生化，中國)提取總RNA，操作按說明書進(jìn)行。用Nanodrop光譜儀(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)檢測RNA純度和濃度。使用逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)將RNA反向轉(zhuǎn)錄為cDNA(Thermo Scientific，CA，USA)，并保存-80 ℃冰箱備用。(3)RT-qPCR：采用CFXTM實(shí)時(shí)系統(tǒng)(Bio-Rad，CA) 和PCR 2 x SYBR qPCR Mix試劑盒(北京中曼生物技術(shù)有限公司)檢測miRNA的水平，擴(kuò)增體系如下：PCR反應(yīng)包含2 μL cDNA、0.4 μL正向引物、0.4 μL反向引物、7.2 μL H2O2和10 μL SYBR；擴(kuò)增條件為25 ℃，10 min，48 ℃，30 min，95 ℃，5 min，U6作為內(nèi)參基因，每個(gè)樣本檢測三次。采用2-ΔΔCt法分析miRNA表達(dá)情況[12]，首先計(jì)算出每個(gè)樣品內(nèi)參基因的表達(dá)量ΔCt，再計(jì)算對(duì)照組中ΔCt的均值，用觀察組每個(gè)樣品的ΔCt減去對(duì)照組的ΔCt均值，得到ΔΔCt，采用2-ΔΔCt公式計(jì)算出觀察組的表達(dá)量。miRNAs引物及擴(kuò)張片段大小如下：miR-186-5p(22bp)：F：5’-CAA AGA AUU CUC CUU UUG GGC U-3’，R：5’-GTG CGT GTC GTG GAG TCG-3’；miR-19a-3p(23bp)：F：5’-UGU GCA AAU CUA UGC AAA ACU GA-3’R，5’-GTG CGT GTC GTG GAG TCG-3’；miR-32-5p(22bp)：F:5’-UAU UGC ACA UUA CUA AGU UGC A-3’，R：5’-GAA TAC CTC GGA CCC TGC-3’；miR-30a-5p(22bp)：5’-CTC AAC TGG TGT CGT GGA GT-3’，R：5’-TGG TGT CGT GGA GTC G-3’；miR-579-3p(23bp)：F：5’-UUC AUU UGG UAU AAA CCG CGA UU-3’，R：5’-GAG CAG GGT CCG AGG T-3’； Let-7e(22bp)：F:5’-UGA GGU AGG AGG UUG UAU AGU U-3’，R：5’-AGA GCC ACA GTC CTC TTT GC-3’；miR-362-3p(22bp)：F:5’-AAC ACA CCU AUU CAA GGA UUC A-3’，R：5’-CGG CAC TGG ATA GAG ATG CG-3’；miR-1238-5p(23bp)：F:5’-GUG AGU GGG AGC CCC AGU GUG UG-3’，R：5’-AGG CAC GGT GTC AGC AGG C-3’；U6 F:5’-CGC AAG GAT GAC ACG CAA ATT CG-3’，R：5’-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3’。

表1 兩組一般資料比較

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞轉(zhuǎn)染 人急性原髓細(xì)胞(HL-60，韓國細(xì)胞庫，韓國)在24孔培養(yǎng)皿中以8×105個(gè)細(xì)胞/mL的密度培養(yǎng)。細(xì)胞均置于DMEM培養(yǎng)基中，輔以10%胎牛血清(FBS；Thermo Fisher Scientific，Inc.，Waltham，MA，USA)、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素在37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。以1×106個(gè)細(xì)胞/mL的密度在含有500 nM的維甲酸[13](ATRA，Sigma，MO)培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d以分化中性粒細(xì)胞。使用中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒(Abcam，Cambridge，UK)評(píng)估中性粒細(xì)胞分化情況。將miR-30a-5p模擬物處理小鼠巨噬細(xì)胞(RAW 264.7，ATCC，VA)，并檢測ARG1表達(dá)和一氧化氮(NO)含量[14]。RAW 264.7在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基(Welgene，Daegu)、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素中培養(yǎng)。將密度達(dá)到1×106cells/mL的RAW 264.7細(xì)胞接種于75-T的培養(yǎng)瓶中于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。miR-30a-5p模擬物(miR-30a-5p，5’-UGUAAACAUCCUCGACUGGAAG-3’)和miR-30a-5p陰性對(duì)照(NC，5’-ACAUCUGUAACUUGUAG- 3’)購自上海基因制藥有限公司，根據(jù)使用說明，取對(duì)數(shù)生長期的HL-60 或RAW264.7細(xì)胞接種于6孔板中，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞達(dá)60%融合時(shí)，采用Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific，Inc.)將miR-30a-5p模擬物、陰性對(duì)照模擬物或mock轉(zhuǎn)染(空白對(duì)照)到HL-60 或RAW264.7細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后，分離細(xì)胞裂解液。

1.2.3 miRNAs靶基因的預(yù)測 采用miRBase(http://www.mirbase.org/)，Target Scan(http://www.targetscan.org/vert_72/)和MicroCosm Target(http://www.ebi.ac.uk)預(yù)測miRNAs的靶基因。查詢與急性腦卒中病理生理學(xué)相關(guān)的靶基因，在選擇miRNAs和靶基因后，對(duì)其進(jìn)行功能研究，以檢查所選擇的miRNAs是否真的與預(yù)測靶點(diǎn)結(jié)合。

1.2.4 雙熒光素酶報(bào)告分析 將對(duì)數(shù)生長期的HL-60細(xì)胞接種到24孔板中(每孔1×103個(gè)細(xì)胞)，待細(xì)胞達(dá)到60%融合時(shí)，將miRNA模擬物和陰性對(duì)照分別與靶基因 3’UTR野生型或突變型重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，使用Renilla luciferase報(bào)告基因(pRL-CMV；Promega公司，美國威斯康星州麥迪遜市)檢測熒光素酶活性，操作按試劑盒(Promega公司)說明書進(jìn)行。

1.2.5 RT-qPCR檢測外周血ARG1 mRNA 采用SuperScript? II First-Strand Synthesis System (Invitrogen，CA)對(duì)樣本總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。使用CFXTM實(shí)時(shí)系統(tǒng)(Bio-Rad，CA)和Quantiect? SYBR Green PCR 試劑盒(Qiagen，CA)定量分析ARG1 mRNA表達(dá)情況，β-actin作為實(shí)驗(yàn)內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算表達(dá)水平。RT-qPCR引物如下：ARG1(1.4kb) F： 5’-TCT GTG GGA AAA GCA AGC GA-3’，R：5’-TTG CCA AAC TGT GGT CTC CG-3’；β-actin： F：5’-GAT CAT TGC TCC TCC TGA GC-3’， R：5’-ACT CCT GCT TGC TGA TCC AC-3’。

1.2.6 Western blot 采用RIA裂解緩沖液(PRO-PREPTM，iNtRON Biotechnology，Korea)和蛋白酶抑制劑(Roche，中國)提取轉(zhuǎn)染后HL-60細(xì)胞系所用總蛋白。使用BCATM蛋白分析試劑盒(Pierce，美國)對(duì)蛋白進(jìn)行定量分析。取相同量總蛋白上樣，經(jīng)10% SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，在37 ℃下用5%脫脂乳封閉1 h，加入一抗(兔抗人ARG1濃度1∶1 000，β-actin濃度1∶1 000)在4 ℃下孵育過夜，隨后，將PVDF膜用TBS洗滌3次，10 min/次。加入羊抗兔二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，TBS洗滌3次，10 min/次。采用Fusion FX5圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.2.7 NO測定 RAW264.7細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，對(duì)NO進(jìn)行測定。轉(zhuǎn)染后，用含脂多糖的新鮮培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步處理(LPS)200 ng /mL，分別孵育0、6、24或48 h。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集3 mL培養(yǎng)基。根據(jù)制造商的說明使用Griess檢測試劑盒(Promega，WI)在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測量NO含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組miRNAs表達(dá)水平比較

病例組和對(duì)照組miR-186-5p、miR-19a-3p、miR-32-5p、miR-362-3p和miR-1238-5p表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而miR-30a-5p、miR-579-3p和Let-7e表達(dá)水平有明顯差異(P<0.001)。見表2。

表2 兩組miRNAs表達(dá)水平比較

2.2 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果

通過取交集分析發(fā)現(xiàn)，miR-579-3p和Let-7e沒有合適的關(guān)于急性腦卒中病理生理學(xué)及免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的靶基因，而miR-30a-5p潛在靶基因是ARG1。ARG1由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮抗炎作用，在腦卒中誘導(dǎo)的外周免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。生物信息學(xué)預(yù)測顯示，ARG1基因的3’端非編碼區(qū)(3’UTR)包含了一個(gè)miR-30a-5p靶序列，見圖1A。在HL-60細(xì)胞系中，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測miR-30a-5p組雙熒光素酶相對(duì)活性明顯低于NC組(P<0.05)，證實(shí)ARG1是miR-30a-5p的直接靶點(diǎn)，見圖1。

2.3 miR-30a-5p對(duì)ARG1的調(diào)節(jié)作用

RT-qPCR檢測表明，與病例組外周血ARG1 mRNA表達(dá)水平比較，對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，見圖2A。miR-30a-5p模擬物轉(zhuǎn)染24 h后，RT-qPCR結(jié)果顯示，ARG1 mRNA表達(dá)水平較mock和NC組明顯降低(P<0.05)，見圖2B。Western blot結(jié)果顯示，miR-30a-5p模擬物轉(zhuǎn)染24 h后ARG1蛋白表達(dá)水平較mock和NC組明顯降低(P<0.05)，見圖2C。

2.4 miR-30a-5p對(duì)RAW 264.7細(xì)胞系中ARG1蛋白的表達(dá)和NO的調(diào)節(jié)作用

Western blot分析表明，miR-30a-5p模擬物轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞24 h后， ARG1蛋白表達(dá)水平較mock和NC組明顯降低(P<0.05)，見圖3A。另外， miR-30a-5p對(duì)LPS處理后的RAW 264.7細(xì)胞48 h后，miR-30a-5p模擬物組NO水平較mock和NC組明顯升高(P<0.05)，見圖3B。

3 討論

miRNAs在急性缺血性腦卒中患者血液中比較穩(wěn)定，可能作為潛在的診斷標(biāo)記[15]。本研究發(fā)現(xiàn)8個(gè)候選miRNAs中miR-30a-5p、miR-579-3p和Let-7e表達(dá)水平在急性缺血性腦卒中外周血和較對(duì)照組存在差異(P<0.05)，表明急性缺血性腦卒中發(fā)生時(shí)外周血miRNAs表達(dá)則會(huì)明顯改變。

熒光素酶報(bào)告基因檢測發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中患者外周血ARG1 mRNA表達(dá)水平相比對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，而RT-qPCR和Western blot發(fā)現(xiàn)，在HL-60或RAW264.7細(xì)胞中miR-30a-5p可以抑制ARG1 mRNA及其蛋白的表達(dá)，證實(shí)ARG1是miR-30a-5p直接作用靶基因。miR-30a-5p過表達(dá)可下調(diào)人中性粒細(xì)胞和小鼠巨噬細(xì)胞ARG1蛋白表達(dá)，表明其可能通過ARG1表達(dá)調(diào)節(jié)缺血性卒中患者的外周免疫應(yīng)答，并參與缺血性卒中的病理生理過程。ARG1是一種細(xì)胞質(zhì)酶，主要在肝臟中表達(dá)，同時(shí)作為尿素循環(huán)的組成部分，也在外周血的免疫細(xì)胞中表達(dá)，參與機(jī)體損傷后的免疫應(yīng)答[16-17]。ARG1通過消耗L-精氨酸來發(fā)揮抗炎作用，抑制Th1細(xì)胞的活力和增強(qiáng)Th2細(xì)胞增殖能力[18-19]。小鼠巨噬細(xì)胞中ARG1通過與iNOS競爭L-精氨酸來抑制NO的產(chǎn)生[20]，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)，ARG1抗炎作用的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步支持了其在巨噬細(xì)胞中表現(xiàn)出高表達(dá)[21]。在炎癥條件下，大量的ARG1從巨噬細(xì)胞、多形核中性粒細(xì)胞和骨髓來源的抑制細(xì)胞中釋放到細(xì)胞外，進(jìn)而抑制T細(xì)胞的增殖[22-23]。研究[24]表明，急性缺血性腦卒中患者的白細(xì)胞中ARG1 mRNA持續(xù)上調(diào)。急性缺血性腦卒中發(fā)生后，受損傷的大腦下游信號(hào)上調(diào)外周血中免疫細(xì)胞ARG1 mRNA水平，并下調(diào)miR-30a-5p的表達(dá)，而miR-30a-5p的下調(diào)，進(jìn)一步增強(qiáng)了ARG1的表達(dá)。Fu等[25]研究表明，miR-30-5p水平在脊髓損傷患者明顯下調(diào)，而miR-30a-5p過表達(dá)可改善炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激。精神類疾病患者腦組織和外周血單核細(xì)胞中，miR-30a-5p同樣明顯下調(diào)，且對(duì)該類疾病的監(jiān)測具有重要作用[26]。Wang等[27]通過探討外泌體microRNAs對(duì)缺血性腦卒中早期診斷的價(jià)值時(shí)指出腦卒中急性期外泌體miR-30a-5p表達(dá)水平降低。上述研究表明，miR-30a-5p在腦卒中等炎癥的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，腦卒中發(fā)生后的分子變化可能與腦組織對(duì)局部炎癥的代償反應(yīng)有關(guān)，并通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)，作為防御機(jī)制激活對(duì)抗促炎信號(hào)途徑。此外，ARG1增加的另一個(gè)原因可能是腦卒中后引起機(jī)體免疫抑制，患者更容易感染和預(yù)后差有關(guān)[28]。中性粒細(xì)胞釋放的ARG1蛋白抑制T淋巴細(xì)胞增殖，減少淋巴細(xì)胞，研究[29]表明血液中ARG1 mRNA的表達(dá)與中風(fēng)的嚴(yán)重程度和不良預(yù)后以及高中性粒細(xì)胞-淋巴細(xì)胞比例密切相關(guān)，而ARG1是miR-30a-5p的靶基因，miR-30a-5p表達(dá)的改變可能參與并作為腦卒中引起的免疫抑制的生物標(biāo)志物。

綜上所述，miR-30a-5p及其靶基因ARG1是急性缺血性腦卒中重要的分子標(biāo)志物之一，miR-30a-5p可能通過抑制靶向基因ARG1表達(dá)參與缺血性卒中免疫應(yīng)答病理生理過程，但具體機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究證實(shí)。