李萌，粘婧，李德華

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)人體解剖學(xué)教研室，遼寧 錦州 121000；2.撫順市中心醫(yī)院，遼寧 撫順 113000)

間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化因子(mesenchymal-epitransition factor，MET)是一種由MET原癌基因編碼的蛋白，MET的異?；罨捎|發(fā)血管生成、腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[1-3]。Maulik等人[4]報道了在SCLC中c-MET/HGF通路的功能，并認(rèn)為該通路可能成為腫瘤治療的一個新靶點(diǎn)。熱休克蛋白70C末端反應(yīng)蛋白(CHIP)是一種u-box型E3泛素連接酶，其底物包括糖皮質(zhì)激素受體、c-Raf激酶、ErbB等致癌蛋白。CHIP可以誘導(dǎo)其底物發(fā)生泛素化以及發(fā)生蛋白酶體降解[5]。人們發(fā)現(xiàn)CHIP表達(dá)上調(diào)可以抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，在人乳腺癌和胃癌中CHIP表達(dá)水平與腫瘤惡性程度呈負(fù)相關(guān)[6]。然而，CHIP對抑制SCLC的確切作用機(jī)制尚不十分清楚。在本研究中，我們擬通過在SCLC細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染構(gòu)建CHIP表達(dá)載體，探討其是否發(fā)揮腫瘤抑制作用。

1 實(shí)驗材料和方法

1.1 實(shí)驗材料

SCLC細(xì)胞株(NCI-H69，NCI-H82，NCI-H209，NCI-H345，NCI-H526)購自上海細(xì)胞庫。MG132購置于sigma公司。DNA提純試劑盒和DNA 擴(kuò)增試劑盒購置于北京天恩澤生物公司；兔抗MET、CHIP、paxillin、pAkt、ERK、FAK抗體及CCK-8試劑盒購于北京博奧森生物技術(shù)公司；pcDNA3載體、 pAcGFP1-N1載體、myc-His A載體、Taq DNA 聚合酶購于大連寶生物公司。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 瞬時轉(zhuǎn)染

細(xì)胞按照 1×105個/孔接種到 6孔培養(yǎng)板中，加入完全培養(yǎng)基，二氧化碳培養(yǎng)箱中 37 ℃過夜。2 μg 的待轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒(陰性對照載體CHIP(-)、CHIP表達(dá)載體CHIP(+)、對照載體pGFP：-和CHIP表達(dá)載體(pGFP-CHIP：+)。同時用 100 μL 的無血清培養(yǎng)基稀釋 5 μL 的Lipofectamine Plus轉(zhuǎn)染試劑，將以上2種溶液混勻，室溫下放置 30 min 左右。細(xì)胞培養(yǎng)至 80%融合時加入 1 mL 的無血清培養(yǎng)基，并將上述混合好的溶液逐滴加入到每孔中，輕搖混勻，二氧化碳培養(yǎng)箱中 37 ℃培養(yǎng) 24 h。將轉(zhuǎn)染液倒出，轉(zhuǎn)染細(xì)胞用MG132或等量的二甲基亞砜(DMSO)培養(yǎng) 3～4 d后檢測蛋白表達(dá)量。

1.2.2 質(zhì)粒和小干擾RNA構(gòu)建

擴(kuò)增編碼全長CHIP的DNA片段，并將其亞克隆至pcDNA3和pAcGFP1-N1中。同時PCR法擴(kuò)增去除TPR和U-box序列的CHIP片段，并亞克隆到pAcGFP1-N1中。同樣，MET亞克隆到pcDNA3和myc-His A中?；虺聊瑢?shí)驗用陰性對照CHIPsiRNA(-)和陽性CHIPsiRNA(+)轉(zhuǎn)染NCI-H69細(xì)胞。

1.2.3 免疫沉淀及免疫印跡檢測

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，于細(xì)胞裂解液中進(jìn)行細(xì)胞裂解。蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。以50 μg/道裂解產(chǎn)物上樣并進(jìn)行SDS電泳，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。分別和一抗(兔抗-CHIP，MET，ERK，F(xiàn)AK，pERK1/2，Akt，pFAK，GFP，Myc，paxillin)進(jìn)行孵育，4 ℃冰箱內(nèi)過夜。HRP標(biāo)記的二抗室溫下孵育1 h，ECL顯像，定量分析條帶密度。免疫沉淀反應(yīng)在細(xì)胞裂解物添加15 μL瓊脂糖，并在搖床上于4 ℃孵育1 h。結(jié)合蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳，最后用免疫印跡法檢測免疫條帶。

1.2.4 細(xì)胞活力試驗

用pcDNA-CHIP(+)或pcDNA(-)空白載體轉(zhuǎn)染的NCI-H69肺癌細(xì)胞株，然后孵育48 h。之后將10 μL CCK-8試劑直接添加到培養(yǎng)基中，繼續(xù)在37 ℃下孵育4 h。最后測量450 nm處的吸光度值。

1.2.5 細(xì)胞凋亡檢測

用CHIP表達(dá)載體轉(zhuǎn)染NCI-H69細(xì)胞并孵育48 h。用PBS洗兩次細(xì)胞后收集細(xì)胞。將約1×105個細(xì)胞重新懸浮在含89 μL結(jié)合緩沖液，1 μL膜聯(lián)蛋白和10 μL碘化丙啶和混合溶液中，在暗室中孵育15 min。細(xì)胞懸液以5000 rpm 離心5 min，收集細(xì)胞顆粒并重新在400 μL結(jié)合緩沖液中懸浮，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。

1.2.6 細(xì)胞侵襲試驗

1.5×105個細(xì)胞懸浮在含1%胎牛血清RPMI 1640中，并置于培養(yǎng)板的培養(yǎng)室中。在下層培養(yǎng)室用含有10%胎牛血清的RPMI 1640作為化學(xué)引誘劑。24 h后，用棉簽將濾紙上表面的細(xì)胞擦拭。將濾池下表面的細(xì)胞用甲醇固定10 min，Giemsa染色孵育3 h后，將細(xì)胞懸浮于10%醋酸溶液中，然后將相同體積的細(xì)胞混合液轉(zhuǎn)移數(shù)到96孔板中，測量560 nm處的光密度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 SCLC細(xì)胞中MET和CHIP表達(dá)

MET在NCI-H69 SCLC細(xì)胞系中呈高表達(dá)狀態(tài)，而在NCI-H526和NCI-H345細(xì)胞系中MET表達(dá)適中，NCI-H209和NCI-H82 SCLC細(xì)胞系中MET呈低表達(dá)狀態(tài)。CHIP在NCI-H209細(xì)胞系中呈高表達(dá)，在NCI-H82和NCI-H345細(xì)胞系中表達(dá)適中，而在NCI-H69和NCI-H526細(xì)胞系中表達(dá)較弱。NCI-H69細(xì)胞系中MET和CHIP的表達(dá)呈相反趨勢，見圖1。

圖1 MET和CHIP在SCLC細(xì)胞系中的表達(dá)

2.2 CHIP調(diào)節(jié)MET誘導(dǎo)的信號蛋白情況

轉(zhuǎn)染pcDNA3-CHIP(+)的NCI-H69細(xì)胞株CHIP呈過表達(dá)狀態(tài)，而MET表達(dá)水平降低，見圖2A；同樣，在檢測CHIP過表達(dá)的NCI-H69中細(xì)胞骨架分子paxillin和FAK時發(fā)現(xiàn)，paxillin和FAK的活化程度較低，CHIP過表達(dá)導(dǎo)致磷酸化的paxillin和FAK水平降低，見圖2B；通過對細(xì)胞的侵襲性觀察，發(fā)現(xiàn)CHIP過表達(dá)的SCLC能夠穿透基質(zhì)凝膠膜的細(xì)胞的數(shù)量顯著減少，見圖2C。

2.3 CHIP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞生長情況

CHIP有效阻止了ERK1/2和Akt1/2的活化，見圖3A；CHIP對NCI-H69細(xì)胞生長和凋亡的影響：與轉(zhuǎn)染pcDNA3空載體的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3CHIP的NCI-H69細(xì)胞在8 h后，NCI-H69細(xì)胞的活力明顯下降，見圖3B；CHIP對細(xì)胞凋亡的有顯著的影響：與空白對照組轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染CHIP基因的NCI-H69細(xì)胞的凋亡水平增加了3倍(P<0.001)，見圖3C、圖3D。

2.4 CHIP與MET的相互作用免疫共沉淀結(jié)果

同時用缺少U-box域(pGFP-CHIPΔU)或缺少TPR域(pGFP-CHIPΔT)GFP標(biāo)記的CHIP與Myc標(biāo)記的MET(pMyc-MET)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染NCI-H69細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在析出的MET復(fù)合體中檢測到U-box突變體，見圖4B；未檢測到TPR突變體，見圖4C，這表明CHIP與MET作用需要TPR域存在。

2.5 TPR和U-box域?qū)τ贑HIP介導(dǎo)的MET降解作用

用Myc標(biāo)記MET、GFP標(biāo)記CHIP或CHIP的突變體(GFP-CHIP和GFP-CHIPΔU)共轉(zhuǎn)染 NCI-H69細(xì)胞，分析MET和GFP表達(dá)發(fā)現(xiàn)，所有構(gòu)建物表達(dá)的蛋白量相似。與可降解MET的野生型CHIP(GFP-CHIP)相反，CHIP的突變體(GFP-CHIPΔT和GFP-CHIPΔU) 都未能檢測到降低MET蛋白表達(dá)水平。說明U-box域和TPR域在CHIP介導(dǎo)的MET降解過程中二者是缺一不可的，見圖5A。

2.6 CHIP與內(nèi)源性MET相互作用

用對照載體(pGFP:-)或CHIP表達(dá)載體(pGFP-CHIP:+)轉(zhuǎn)染NCI-H69細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞CHIP過表達(dá)后，MET蛋白水平恢復(fù)正常，見圖5B；在轉(zhuǎn)染陰性對照載體(-)或CHIP表達(dá)載體(+)的NCI-H69細(xì)胞中觀察MET的聚泛素化情況，發(fā)現(xiàn)聚泛素化的MET表現(xiàn)為典型的成片條帶，CHIP過表達(dá)時條帶強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，提示受體聚泛素化水平升高，見圖5C。

A：pcDNA3(-)空白載體和pcDNA3-CHIP轉(zhuǎn)染NCI-H69細(xì)胞48 h后，CHIP和MET表達(dá)情況。β-actin為內(nèi)參；B：NCI-H69細(xì)胞p-paxillin、paxillin、p-FAK、FAK免疫印結(jié)果。β-actin為內(nèi)參；C：pcDNA3(-)轉(zhuǎn)染與pcDNA3-CHIP(+)轉(zhuǎn)染的侵襲的細(xì)胞數(shù)量對比，*P<0.05

A：pAkt1/2、Akt1/2、pERK1/2、ERK1/2和CHIP免疫印跡圖，β-actin為內(nèi)參?！?”= pcDNA3載體，“+”=pcDNA3-CHIP載體；B:CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染pcDNA3空白載體和pcDNA3-CHIP載體后細(xì)胞活力；C、D：annexin-V/PI法檢測細(xì)胞凋亡

A：CHIP和MET的免疫共沉淀；B：缺乏U-box域(CHIPΔU)和MET的共免疫共沉淀；C：缺乏TPR域(CHIPΔT)和MET的免疫共沉淀。GFP：綠色熒光蛋白；IP：免疫沉淀分析；IB：免疫印跡分析

A：MET和GFP蛋白水平的免疫印跡結(jié)果；B：MG132處理細(xì)胞MET，GFP的免疫印跡結(jié)果；C：MET和泛素表達(dá)免疫印跡結(jié)果；

2.7 NCI-H69細(xì)胞內(nèi)源性CHIP基因沉默后MET水平變化

陰性對照CHIPsiRNA (-)或陽性CHIPsiRNA (+)轉(zhuǎn)染NCI-H69細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)CHIP和MET表達(dá)亦呈相反關(guān)系，即：CHIP表達(dá)減少，MET表達(dá)增加，見圖6A；表明通過CHIP-siRNA基因沉默內(nèi)源性CHIP蛋白可以增加內(nèi)源性MET表達(dá)。MET和CHIP免疫沉淀分析結(jié)果顯示，CHIP基因沉默可誘導(dǎo)MET和CHIP蛋白的分解，見圖6B。

A：轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA和CHIP siRNA后48 h，CHIP和MET表達(dá)水平；B：MET和CHIP免疫共沉淀結(jié)果

3 討 論

CHIP是一個具有U -box結(jié)構(gòu)域的E3泛素連接酶，通過其TPR域可以與Hsp90和Hsp70上獨(dú)立的TPR受體位點(diǎn)結(jié)合，介導(dǎo)其他Hsp90/Hsp70受體蛋白的泛素化[6]368-377。我們發(fā)現(xiàn)，CHIP與MET在NCI-H69細(xì)胞和其他多個SCLC細(xì)胞系中的表達(dá)都呈反比關(guān)系。為了確定CHIP過表達(dá)是否對SCLC細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移起作用，我們用CHIP轉(zhuǎn)染細(xì)胞下調(diào)MET的表達(dá)，隨后分析MET下調(diào)對SCLC細(xì)胞表型的影響。實(shí)驗中CHIP能夠特異性降低NCI-H69細(xì)胞中MET的表達(dá)水平。此外，我們還發(fā)現(xiàn)SCLC細(xì)胞的侵襲能力和遷移性能明顯受到細(xì)胞骨架分子paxillin和FAK的調(diào)控，這些分子的激活又受MET的調(diào)節(jié)[7]。通過CHIP介導(dǎo)的MET抑制，paxillin和FAK的磷酸化水平均降低，這直接影響到腫瘤細(xì)胞的侵襲性并導(dǎo)致其活性降低。有報道證明，MET介導(dǎo)的Akt1/2和ERK1/2通路是參與SCLC細(xì)胞生存、增殖和分化的主要通路[8]。我們發(fā)現(xiàn)CHIP過表達(dá)降低了NCI-H69細(xì)胞中Akt1/2和ERK1/2的磷酸化水平。因此，在CHIP過表達(dá)的情況下，Akt1/2或ERK1/2磷酸化和信號傳導(dǎo)的減少與MET誘導(dǎo)的降解是一致的。NCI-H69細(xì)胞中CHIP過表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加。

CHIP的主序列和結(jié)構(gòu)顯示其具有3個域：即N端的TPR域、C端的U-box域和中間的電荷域[9]。U-box結(jié)構(gòu)域與鋅指基因(really interesting new gene，RING)結(jié)構(gòu)域有關(guān)，這兩個結(jié)構(gòu)域都賦予E3泛素連接酶活性[10-11]。CHIP的N端TPR域可以特異性地與Hsp70、Hsp90等多個伴侶分子相結(jié)合。由于CHIP通過TPR域與Hsp90或Hsp70相互作用，我們的結(jié)果提示在CHIP誘導(dǎo)的MET降解過程中可能有一種伴侶分子參與其中。促進(jìn)泛素連接酶活性的C-端U-box域和N端TPR域，都是CHIP介導(dǎo)的MET降解過程中的必需結(jié)構(gòu)域，二者缺一不可。本實(shí)驗中，CHIP過表達(dá)促進(jìn)了SCLC細(xì)胞株中的MET泛素化和降解。

CHIP與MET結(jié)合以及發(fā)生交互作用是需要U-box域還是TPR域。我們將GFP標(biāo)記的全長CHIP(pGFP-CHIP)表達(dá)載體和Myc標(biāo)記的MET (pMyc-MET)表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染給NCI-H69細(xì)胞。同時用缺乏U-box域(pGFP-CHIPΔU)或TPR域(pGFP-CHIPΔT)的GFP標(biāo)記的CHIP與Myc標(biāo)記的MET(pMyc-MET)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染NCI-H69細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在析出的MET復(fù)合體中檢測到U-box突變體，而未檢測到TPR突變體，這說明CHIP與MET相互作用需要TPR域的存在。我們發(fā)現(xiàn)CHIP的N端TPR域?qū)ET結(jié)合和相互作用是必不可少的。