王立國 郭月寧 劉喃喃

肝肺綜合征(hepatopulmonmy syndrome HPS)是在慢性肝病基礎上形成的以肺微血管擴張、低氧血癥為主要特征的一種疾病，是終末期肝硬化患者最嚴重的并發(fā)癥，成人終末期肝病患病率為4%～47%，發(fā)病機制未完全闡明，治療效果差，病死率高[1-2]。目前多數(shù)研究認為，低氧血癥是HPS發(fā)病的重要原因，高壓氧可治療大鼠HPS[3]。低氧血癥的病理生理基礎是肺微血管擴張[4]。引起肺微血管擴張的因素很多，目前研究主要集中在血管活性物質方面，如一氧化氮(nitric oxide,NO)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factors,TNF-α)、一氧化碳(carbon monoxide,CO)等，通過不同途徑促進肺微血管內(nèi)皮細胞(pulmonary microvascular endothelial cells,PMVEC)增殖，引起細胞通透性增強，從而導致肺微血管擴張而產(chǎn)生低氧血癥。

研究表明，白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)在免疫調(diào)節(jié)、造血、炎癥與腫瘤發(fā)生方面具有廣泛生物學活性，其可以聯(lián)合WBC及NLR值作為評估慢加急性肝衰竭患者早期預警指標[4-6]。細胞因子多數(shù)通過結合特定受體并激活一些信號轉導通路而發(fā)揮調(diào)控作用。IL-6/JAK2/STAT3信號通路是一條重要的轉導通路，被廣泛報道參與到細胞增殖過程中，在細胞周期、細胞增殖領域中具有良好的研究基礎。本實驗通過建立大鼠HPS模型，體外分離培養(yǎng)PMVEC，研究IL-6對肺微血管細胞增殖的作用，并闡明IL-6/JAK2/STAT3信號通路在HPS發(fā)病機制中的重要意義。

資料與方法

一、動物、儀器和試劑

Wistar大鼠40只，體質量為180～ 250 g[實驗動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK(魯)20130001]；PCR儀購置ABI Biosystems公司，型號ABI7000；流式細胞儀購置美國BD公司，型號FAC-Scan；超聲采用加拿大Sonix OP診斷系統(tǒng)；低糖DMEM培養(yǎng)基為美國PAA公司；植物凝集素購于美國Sigma公司；RT-PCR相關試劑及抗體購自美國Thermo公司；蛋白質印跡相關試劑及抗體購置于美國Cell Signaling公司和武漢博士德生物技術有限公司等；部分MTT溶液等按標準步驟配制而成。

二、動物模型制備

采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為實驗組和對照組，每組20只，實驗組采用膽總管結扎法建立大鼠HPS模型，而對照組僅開腹并分離膽總管，無其他處置。術前禁食8 h，4%水合氯醛1 mL/100 g腹腔內(nèi)注射麻醉，固定操作臺，沿腹白線開腹，于胃竇尋找十二指腸降段，找到并分離膽總管，用4-0線在膽總管末端雙線結扎后關腹。術后分籠飼養(yǎng)，觀察大鼠皮膚光澤色澤、排尿顏色、精神狀態(tài)等，并檢測動脈血氧分壓及NO濃度來驗證造模是否成功。腹部超聲觀察膽總管擴張情況。HPS模型大鼠處死，取出肝臟及肺臟組織10%甲醛固定，包埋蠟塊并切片H-E染色，觀察肝臟纖維化及假小葉形成情況，以及肺臟微血管擴張表現(xiàn)。

三、大鼠PMVEC分離與培養(yǎng)

組織塊法培養(yǎng)原代PMVEC，在低糖DMEM培養(yǎng)基中加入肝素，采用植物凝集素BSI結合實驗鑒定培養(yǎng)的細胞是否為PMVEC。

四、血漿相關指標檢測

RT-PCR方法檢測IL-6 mRNA表達，引物IL-6(509bp)：F-GAC TGA TGT TGT TGA CAG CCA CTG C;R-TAC CCA CTC CTT CTG TGA CTC TAA CT, 反應條件為94 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，63 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，33個循環(huán)72 ℃ 7 min，所用試劑盒為美國Thermo公司；ELISA法按照試劑盒說明書檢測IL-6蛋白水平；MTT和流式細胞術分別檢測PMVECs增殖和凋亡情況；蛋白質印跡方法測定pJAK和pSTAT的蛋白表達。

五、統(tǒng)計學處理

結 果

一、大鼠HPS動物模型建立成功

在膽總管結扎術后4～6周，動物肝硬化形成，部分并發(fā)HPS。術后3 d，大鼠精神萎靡，膚色及尿液變黃，一般狀態(tài)差，動脈血氣氧分壓下降，血漿NO水平升高，2周后更加明顯，4周后超聲見膽總管擴張。4～6周將大鼠處死觀察，膽總管明顯擴張、肝臟表面見纖維條索瘢痕，病理示肝臟假小葉形成(圖1)及肺微血管擴張(圖2)，表明大鼠HPS建模成功。

圖1 肝病理組織學變化 術后4周肝臟炎細胞浸潤、結締組織增生部分假小葉形成(H-E，400X)

圖2 肺組織病理學變化 術后6周肺微血管擴張，并見少量紅細胞位于肺泡腔

二、 IL-6在大鼠HPS模型中的表達水平

對比常用炎癥細胞因子，如TNF-α、IL-8、IL-1和IL-6，通過實時定量PCR方法發(fā)現(xiàn)IL-6的mRNA水平明顯高于對照組，P<0.05,差異有統(tǒng)計學意義；ELISA方法檢測IL-6蛋白水平，結果表明其IL-6水平明顯高于其它組。表明IL-6的表達水平在大鼠HPS模型中顯著增加。

三、IL-6促進了PMVEC的增殖水平以及抑制了脂多糖所誘導的細胞凋亡

IL-6作用于體外分離培養(yǎng)的PMVEC，通過MTT方法檢測其細胞增殖情況，結果顯示，PMVECs在96孔板中以2 000個細胞每孔的密度培養(yǎng)1,3,5或7天，IL-6組和非IL-6組相比，IL-6促進了PMVEC增殖水平；我們對PMVEC進行脂多糖處理，并且加入或者不加入IL-6，以200 000個細胞每孔的密度培養(yǎng)12 h，然后通過流式細胞術的方法對細胞凋亡進行檢測。結果顯示IL-6對于脂多糖所誘導的PMVEC的凋亡現(xiàn)象具有明顯的降低效應。

四、IL-6可以激活PMVEC的JAK2/STAT3信號通路

PMVECs進行IL-6處理，12 h后通過Western Blot的方法對JAK的磷酸化水平進行檢測。PMVEC被IL-6處理12 h后，JAK2的磷酸化水平顯著性地增加了，而同一時間，JAK1和JAK3的mRNA水平在這些實驗組的PMVEC中卻沒有明顯的變化。

五、JAK表達的下降抑制了PMVEC的增殖以及誘導了IL-6所激活的細胞凋亡

我們對PMVECs進行JAK2的敲除，然后通過MTT實驗來檢測細胞增殖水平。結果顯示JAK2的mRNA水平被RNAi所顯著性地敲除，而STAT3也是處于沒有被激活的狀態(tài)，當PMVEC被IL-6所處理后，下調(diào)表達的JAK2可以抑制細胞增殖的水平。通過流式細胞術的方法檢測了細胞周期的水平，結果顯示在JAK2被敲除后，G1/G0期的比例明顯增加了，而S期以及G2/M期的水平顯著性地降低了。同時我們對PMVEC進行STAT3的敲除。結果顯示在對細胞進行STAT3的siRNA的轉染后，PMVEC的STAT3處于沒有被激活的狀態(tài)。因而，我們的結果顯示STAT3可以促進PMVEC的增殖，細胞周期的進程，以及抑制細胞凋亡。

討 論

HPS病因不清，發(fā)病機制復雜，目前認為肺微血管擴張及低氧血癥參與其發(fā)生過程。多數(shù)學者認為PMVECs增殖和新生血管的形成在HPS發(fā)病機制中作用明顯[7]。其促發(fā)因素包括多種血管活性物質和細胞因子，如NO、CO、TNF-α等，近些年來IL-6的作用得到重視，其參與多種細胞病理生理活動，如細胞增殖、分化等。

HPS的研究多數(shù)基于動物實驗，因此動物模型的成功建立尤為重要，目前普遍認為膽總管結扎術式建模成功率高[8]，我們的實驗也證明了這一點。在HPS模型判斷上我們的創(chuàng)新之處是在術前和術后分別給予大鼠行超聲波檢查，判斷膽總管寬度，之后再行動脈血氣分析和血漿NO水平測定，這樣可更準確判斷模型建立。

目前研究認為多種血管活性物質及細胞因子參與到了PMVECs的增殖及微血管擴張中，并促進了HPS的發(fā)生[9]。其中NO是目前公認的擴血管物質，通過PMVECs產(chǎn)生的內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性增加，參與HPS的形成與發(fā)展[10]。而HPS形成時因腸黏膜屏障影響形成腸源性內(nèi)毒素血癥，內(nèi)毒素可刺激炎癥相關細胞因子的產(chǎn)生，如TNF-α、IL-1、IL-6等，促進NO產(chǎn)生并舒張肺血管[11]，從而引起HPS發(fā)生。本實驗也證明了這一觀點。我們通過實時定量PCR的方法在大鼠HPS模型中測定多種炎癥細胞因子，包括TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8，結果發(fā)現(xiàn)IL-6的mRNA水平較對照組明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義。我們將PMVEC進行體外培養(yǎng)，采用ELISA方法檢測IL-6的蛋白水平，結果得出與mRNA一致的現(xiàn)象，以上結果表明IL-6的表達水平在大鼠HPS模型中顯著增加。

既往研究認為部分細胞因子參與PMVEC的增殖，促進了新生肺血管的形成，那么IL-6是否具有這些特征呢？筆者通過實驗進一步研究了IL-6對PMVEC增殖的影響。體外分離培養(yǎng)了PMVEC，將IL-6作用于該細胞，采用MTT方法對細胞增殖進行檢測，結果表明，IL-6促進了PMVEC的增殖；同時采用脂多糖誘導了PMVEC凋亡，通過兩組(加IL-6組和不加IL-6組)對比研究，采用流式細胞術的方法進行細胞凋亡檢測，結果表明IL-6對脂多糖誘導的PMVEC的凋亡現(xiàn)象具有明顯的降低效應。因此，筆者認為IL-6具有促進PMVEC增殖并抑制細胞凋亡的作用。

眾所周知，細胞因子是通過特定細胞傳導通路而發(fā)揮調(diào)控作用，而目前國際上對于IL-6/JAK/STAT這一信號通路研究較多，在炎癥、腫瘤、細胞增殖及凋亡中被廣泛報道[12-14]。在細胞周期、細胞增殖領域中具有良好的研究基礎，筆者的實驗也進一步研究證明了IL-6對細胞增殖的影響是通過激活JAK2/STAT3信號轉導通路實現(xiàn)的。我們對PMVEC進行IL-6的處理，12 h后通過Western Blot的方法對JAK的磷酸化水平進行檢測。當PMVEC被IL-6處理12 h后，JAK2的磷酸化水平顯著性地增加了，而同一時間，JAK1和JAK3的mRNA水平在這些實驗組的肺臟微血管內(nèi)皮細胞中卻沒有明顯的變化。同時對PMVECs進行JAK2的敲除，然后通過MTT實驗和流式細胞來檢測細胞增殖及凋亡水平，結果表明STAT3可以促進PMVEC的增殖，細胞周期的進程，以及抑制細胞凋亡。研究證明，IL-6/JAK2/STAT3信號轉導通路參與了PMVEC的增殖調(diào)控中，促進了HPS的形成。

綜上所述，HPS發(fā)病機制復雜，對其基礎研究經(jīng)驗主要來源于動物實驗。HPS的膽總管結扎模型成功率高，但需注重幾個細節(jié)。IL-6在HPS發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用，具有促進PMVEC增殖及抑制凋亡作用，其發(fā)生作用的關鍵信號轉導通路為JAK2/STAT3途徑。我們的發(fā)現(xiàn)為更好地認識HPS的病理機制提供了理論基礎，但IL-6在HPS中研究較少，作用機制復雜，需要有更多的實驗去論證與支持。