何清 李陽 姜里航 鄧盼盼 劉偉 繆宇飛

手術(shù)是肝細(xì)胞癌的主要治療手段，但疾病術(shù)后較高的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率一直是影響患者遠(yuǎn)期療效的關(guān)鍵因素[1]，故早期預(yù)測肝細(xì)胞癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)意義重大。同種異體自然殺傷細(xì)胞(natural killer cells，NK)是天然免疫關(guān)鍵組成部分，參與了病毒感染細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的清除[2]，研究發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞癌患者腫瘤細(xì)胞免疫逃逸與NK細(xì)胞功能缺陷息息相關(guān)[3-4]。肝癌患者機(jī)體免疫功能低下，除NK細(xì)胞分布發(fā)生改變外，患者T淋巴細(xì)胞亞群水平也有變化，而這種變化在一定程度上會影響到NK細(xì)胞的活性[5]。二者相互作用參加并推動(dòng)了肝細(xì)胞癌的發(fā)生與發(fā)展，但是否與患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)尚無定論。本研究觀察原發(fā)性肝癌患者術(shù)后外周血T淋巴細(xì)胞亞群與NK細(xì)胞水平在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者中的表達(dá)，旨在分析二者間的關(guān)系，以指導(dǎo)臨床。

資料與方法

一、一般資料

回顧分析，選擇2017年3月至2019年3月期間接受肝切除術(shù)治療的58例原發(fā)性肝癌患者作為研究對象，根據(jù)患者術(shù)后隨訪復(fù)發(fā)情況將其分為復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組與未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組，其中復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組21例，未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組37例。全部患者的臨床資料完整，且均經(jīng)組織病理學(xué)確診為原發(fā)性肝細(xì)胞癌，排除合并其他惡性腫瘤疾病的患者、合并原發(fā)性免疫功能障礙的患者、因其他疾病導(dǎo)致的免疫功能低下的患者，全部患者6個(gè)月內(nèi)均未接受免疫調(diào)節(jié)治療。復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組21例患者中男性患者13例，女性患者8例；年齡37～75歲，平均(54.12±2.01)歲；肝功能Child-Pugh評級[6]：A級17例，B級4例。未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組37例患者中男性23例，女性患者14例；年齡38～75歲，平均(54.22±1.96)歲；肝功能Child-Pugh評級：A級30例，B級7例。兩組一般資料差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，有可比性。

二、研究方法

全部患者均接受外周血T淋巴細(xì)胞亞群與NK細(xì)胞水平表達(dá)檢測。

(1)主要儀器與試劑：全部儀器與試劑均由美國Beck-man coulter公司提供，包括Coulter QPREP自動(dòng)溶血儀、Epics XL型流式細(xì)胞儀、鼠抗人單克隆抗體CD4/CD3/CD8/CD45，ABC溶血素。

(2)外周血采集方法：患者晨起后空腹?fàn)顟B(tài)下采集外周血5 mL，對采集得到的血樣本行密度梯度離心，分離血漿與血清。

(3)T淋巴細(xì)胞亞群檢測：吸取100 μL抗凝血分別經(jīng)熒光素標(biāo)記的各鼠抗人單克隆抗體混勻，避光在室溫下反應(yīng)30 min，60 min內(nèi)上機(jī)測定結(jié)果，計(jì)算CD3+、CD4+、CD8+、CD3+/CD4+、CD3+/CD8+，主要比較各組患者的CD3+、CD3+/CD4+、CD3+/CD8+表達(dá)。

(4)NK細(xì)胞水平檢測：收集上層血漿滅活后采集單核細(xì)胞層的細(xì)胞，向內(nèi)加入生理鹽水以重懸，后按照步驟進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞收獲、細(xì)胞質(zhì)控，最終得到NK細(xì)胞的純度與表達(dá)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、兩組患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群與NK細(xì)胞水平比較

復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組CD3+、CD3+/CD4+、NK細(xì)胞表達(dá)均低于未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組，CD3+/CD8+表達(dá)高于未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組外周血T淋巴細(xì)胞亞群相關(guān)指標(biāo)、NK細(xì)胞水平比較(±s)

二、外周血T淋巴細(xì)胞亞群各指標(biāo)、NK細(xì)胞水平與原發(fā)性肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移關(guān)系的線性回歸結(jié)果

將外周血T淋巴細(xì)胞亞群各指標(biāo)及NK細(xì)胞作為自變量，原發(fā)性肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移作為因變量，行線性回歸分析結(jié)果顯示，CD3+與原發(fā)性肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移無關(guān)，CD3+/CD4+、CD3+/CD8+、NK細(xì)胞水平變化可能是原發(fā)性肝癌患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的影響因素，得到線性回歸方程：Y=0.904+0.049X2-0.088X3+0.063X4。見表2。

表2 外周血T淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞水平與患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移關(guān)系的線性回歸結(jié)果

討 論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與免疫功能狀態(tài)的異常改變有關(guān)，淋巴細(xì)胞反映并參與了機(jī)體免疫功能，參與了抗腫瘤免疫反應(yīng)，正常的免疫狀態(tài)是機(jī)體抗腫瘤的關(guān)鍵機(jī)制[7-8]。研究認(rèn)為，免疫狀態(tài)異常不僅參與了腫瘤的發(fā)生，還可能與腫瘤的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)有關(guān)[9]。

目前T淋巴細(xì)胞亞群較常見的指標(biāo)多為表面抗原，有CD3、CD4、CD8等，其中CD4是一種外周血特殊淋巴細(xì)胞，是主要的輔助性淋巴細(xì)胞；CD8則是淋巴細(xì)胞毒性主要標(biāo)志物；CD3為所有T淋巴細(xì)胞亞群的代表及標(biāo)志[10-11]。CD3+與CD4+的比值、CD3+與CD8+的比值能夠直接反映宿主機(jī)體T淋巴細(xì)胞亞群的平衡狀態(tài)，是臨床用于評估機(jī)體細(xì)胞免疫功能狀態(tài)的關(guān)鍵性標(biāo)志物[12]。除外周血T淋巴細(xì)胞亞群外，NK細(xì)胞也被用于機(jī)體免疫活性的評價(jià)，是一種主要的非特異性免疫活性細(xì)胞，具有非抗體依賴性細(xì)胞毒性，多用于各類肝炎、肝細(xì)胞癌、健康人群免疫活性檢測與對比，能夠反映不同人群的細(xì)胞免疫平衡狀態(tài)差異，現(xiàn)多用于各類肝炎與肝癌鑒別診斷[13-15]。惡性腫瘤患者機(jī)體免疫力低下，T淋巴細(xì)胞亞群與NK細(xì)胞分布均發(fā)生變化[16]。早在2005年，周啟明等[17]研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞可以大量生成并分泌出免疫抑制因子，導(dǎo)致NK細(xì)胞活性下降；其次，因CD3+/CD4+主要為輔助性T細(xì)胞，可分泌大量炎性因子，如白細(xì)胞介素-12等，這對增強(qiáng)NK細(xì)胞的活性有一定意義，一旦該細(xì)胞功能降低，將影響到NK細(xì)胞活性，故機(jī)體免疫力受損?？梢娡庵苎猅淋巴細(xì)胞亞群與NK細(xì)胞之間存在相互影響、相互作用的關(guān)系，二者雖已被證實(shí)參與了原發(fā)性肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展[18]，但是否與患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)尚未證實(shí)。本研究結(jié)果顯示，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組CD3+、CD3+/CD4+、NK細(xì)胞表達(dá)均低于未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組，CD3+/CD8+表達(dá)高于未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組，初步提示外周血T淋巴細(xì)胞亞群與NK細(xì)胞水平異常變化引起的免疫狀態(tài)異?？赡軈⑴c了肝細(xì)胞癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步行回歸檢驗(yàn)結(jié)果顯示，CD3+與患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移無關(guān)，而CD3+/CD4+、CD3+/CD8+、NK細(xì)胞均可能參與了肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。究其原因，肝癌患者術(shù)細(xì)胞免疫功能受抑制，即使是接受手術(shù)治療，在術(shù)后患者機(jī)體內(nèi)各有毒物質(zhì)未被及時(shí)有效的清除，為癌細(xì)胞的增殖與生長創(chuàng)造了有利的免疫環(huán)境，故術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)提高，可見肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是機(jī)體免疫功能紊亂的延續(xù)。但因本研究尚無較多循證依據(jù)支持，加之研究為回顧分析類，得到的資料、信息等均可能與實(shí)際有偏差，結(jié)果可能存在偏倚，研究尚有局限，還需要在未來進(jìn)一步分析研究加以驗(yàn)證。