張君佩 陳穎 沈丹杰 劉海玲 田怡 陳世耀

肝星狀細胞(HSC)是肝纖維化的主要效應細胞，當肝臟受到損傷因子刺激時，HSC鄰近細胞通過旁分泌作用釋放多種細胞因子啟動HSC的活化，使其轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂性鲋承?、收縮性和促纖維性的肌成纖維細胞。同時，HSC活化后會分泌大量細胞因子，通過該自分泌途徑導致HSC的持續(xù)活化以及肝纖維化的持續(xù)進展[1]。因此，深入了解HSC活化的分子機制，尋找新的靶點阻斷HSC的持續(xù)活化是逆轉(zhuǎn)肝纖維化進展的關(guān)鍵。

RNA甲基化修飾(m6A)是真核生物中最普遍的轉(zhuǎn)錄后修飾方式，廣泛存在于肝臟、腎臟及大腦等多個器官中[2]。與DNA甲基化相似，m6A是一種可逆的動態(tài)修飾，受甲基轉(zhuǎn)移酶(METTL3、METTLl4、WTAP等)和去甲基酶(FTO、ALKBH5等)的共同調(diào)控[3,4]。METTL14是m6甲基轉(zhuǎn)移酶復合物的重要組分之一，其在體外的甲基化轉(zhuǎn)移能力高于METTL3[5]。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌樣本中的METTLl4水平顯著下調(diào)，而過表達METTLl4后能夠抑制肝癌的轉(zhuǎn)移能力[6]。本研究檢測HSC活化后METTLl4的表達水平，進一步研究METTLl4對HSC活化的影響，以闡明METTLl4在肝纖維化中的調(diào)節(jié)機制。

資料與方法

一、材料與試劑

肝星狀細胞系(HSC-T6)購自中國科學院上海細胞庫；TGF-β1、Trizol、MTT以及嘌磷霉素購自美國Sigma公司；胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基以及青霉素-鏈霉素(100X)購自美國Gibco公司；RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0以及SYBR Premix ExTaqTM試劑盒購自日本TaKaRa公司；METTL14過表達載體 pGCMV-IRES-EGFP-METTL14以及陰性對照載體pGCMV-IRES-EGFP-NC由上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司構(gòu)建；RT-qPCR的引物由上海生物生工有限公司合成；抗-COL I、抗-α-SMA、抗-GAPDH抗體以及二抗購自英國Abcam公司；Trizol、Lipofectamine 2000購自美國Thermo Fisher Scientific公司；其他試劑購自國藥集團化學有限公司。

二、細胞培養(yǎng)與活化誘導

HSC-T6細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清以及1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37℃、體積分數(shù)為0.05的二氧化碳養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。調(diào)整HSC-T6的細胞密度，按1×106濃度接種于6孔板中，細胞貼壁后，將6個孔分為兩組，每組作三個平行。TGF-β1組加入2 ng/mL TGF-β1和對照液共培養(yǎng)，24 h后進行相關(guān)檢測。

三、實時定量PCR

采用Trizol法提取細胞總RNA，根據(jù)試劑盒的說明將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用SYBR Premix ExTaqTM試劑盒進行RT-qPCR。GAPDH作為內(nèi)參，引物序列如下，METTL14正向：5′-AGT GCC GAC AGC ATT GGT G-3′，反向：5′-GGA GCA GAG GTA TCA TAG GAA GC-3′；I型膠原(COL1)正向：5′-GAG GGC CAA GAC GAA GAC ATC-3′，反向：5′-CAG ATC ACG TCA TCG CAC AAC-3′；α-平滑肌動蛋白(α-SMA)正向：5′-AAA AGA CAG CTA CGT GGG TGA-3′，反向：5′-AAA AGA CAG CTA CGT GGG TGA-3′；GAPDH正向：5′-ACA ACT TTG GTA TCG TGG AAG G-3′，反向：GCC ATC ACG CCA CAG TTT C-3′。結(jié)果采用熒光定量PCR中的相對定量法，以2-△△Ct表示基因的相對表達水平。

四、細胞轉(zhuǎn)染

按1×106濃度將HSC-T6細胞接種于6孔板，待細胞貼壁后，根據(jù)Lipofectamine 2000的操作說明將METTL14的過表達載體(METTL14組)及陰性對照載體(NC組)分別轉(zhuǎn)染至HSC-T6細胞中，48 h后加入2 μg/mL嘌呤霉素篩選細胞，并進行RT-qPCR驗證。

五、MTT檢測

取對數(shù)期METTL14組及NC組的HSC-T6細胞，按照每孔5 000個細胞接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h及48 h后，按照MTT試劑盒說明書分別在相應的孔中加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)完成后，棄去孔內(nèi)上清液，每孔加入200 μL DMSO，避光震蕩10 min，在酶標儀上測定各孔在492 nm處的吸光度值(A)。

六、遷移檢測

取對數(shù)期METTL14組及NC組的HSC-T6細胞，采用無胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，按照每孔3×104個細胞接種于8 μm的transwell小室的上室，在下室中加入600 μL DMEM完全培養(yǎng)基。24 h后，用棉簽擦除上室的細胞，PBS洗兩次，然后加入適量0.1%的結(jié)晶紫染液處理20min。染色完成后，置于顯微鏡下拍照、計數(shù)。

七、蛋白質(zhì)印跡分析

取對數(shù)期METTL14組及NC組的HSC-T6細胞，接種于6孔板中，細胞融合至80%～90%時，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液提取細胞總蛋白，并用BCA試劑盒確定蛋白濃度。蛋白變性后取等量的蛋白上樣，置于9%SDS-PAGE電泳中分離蛋白。將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF上，加入5%脫脂奶粉，室溫封閉2 h。加入一抗(抗-COL I 1∶2000；抗-α-SMA 1∶2000；抗-GAPDH，1∶5000)，4℃孵育過夜。次日，加入二抗(1∶3000)，室溫孵育2 h。采用ECL化學發(fā)光試劑盒顯色，并拍照。

八、統(tǒng)計學方法

所用統(tǒng)計軟件為SPSS 17.0。正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以均值±標準差表示，兩組和兩組以上組間比較分別采用非配對t檢驗和單因素方差分析(one-way ANOVA)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、TGF-β1對HSC-T6細胞中METTL14表達的影響

TGF-β1與HSC-T6細胞共培養(yǎng)后，TGF-β1組中METTL14的相對表達水平為(3.78 ± 0.45)高于對照組的(1.00 ± 0.21)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明TGF-β1促進METTL14的表達，METTL14的高表達可能與肝纖維化有密切的關(guān)系。

二、METTL14過表達對HSC-T6增殖和遷移的影響

對照組中METTL14的相對表達水平為(1.00 ± 0.18)，過表達組中METTL14的表達為(6.04±0.64)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。MTT檢測過表達組HSC-T6細胞在24 h及48 h的吸光度，結(jié)果顯示24 h后，過表達METTL14組與對照組的吸光度分別為0.313 ± 0.032，0.264 ± 0.018，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；48 h后，METTL14過表達組的吸光度為0.730 ± 0.047，高于對照組的(0.533 ± 0.022)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Transwell分析表明，過表達METTL14組HSC-T6的細胞遷移數(shù)為186.00 ± 42.75，而對照組僅為97.00 ± 7.00(圖1)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明過表達METTL14組的遷移能力顯著增強。上述結(jié)果表明METTL14能夠刺激HSC-T6的增殖與遷移能力。

圖1 過表達METTL14對HSC-T6遷移能力的影響(×400)

三、METTL14過表達對COL I及α-SMA的影響

METTL14組中COL I的相對表達水平為(2.48 ± 0.31)，高于對照組的(1.00 ± 0.26)，(P<0.05)，α-SMA的相對表達水平為(3.36 ± 0.43)亦高于對照組的(1.00 ± 0.24)，(P<0.05)。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果進一步證實，METTL14組中的COL I與α-SMA的蛋白水平明顯高于對照組(圖2)，表明METTL14能夠促進HSC-T6的活化。

圖2 過表達METTL14對HSC-T6中COL I與α-SMA蛋白表達的影響

討 論

TGF-β1是目前已知很強的促肝纖維化細胞因子[7]。本研究將TGF-β1與HSC-T6共培養(yǎng)誘導其活化，結(jié)果顯示METTL14的表達顯著增加，表明METTL14的上調(diào)可能與肝纖維化相關(guān)。HSC的增殖與活化是肝纖維化的中心環(huán)節(jié)[8,9]，活化的HSC細胞可分泌過量的ECM如COL Ⅰ與COL Ⅲ以及細胞骨架蛋白α-SMA。本研究顯示過表達METTL14后顯著促進HSC-T6的增殖，遷移以及COL I與α-SMA的表達合成，表明METTL14的異常高表達是HSC增殖、活化的重要機制。

m6A是真核細胞RNA中豐度最高的修飾方式，參與RNA分子的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，包括RNA的剪接、輸出、定位、降解以及翻譯[10-12]。METTL14是m6A修飾所必需的甲基轉(zhuǎn)移酶，可以與METI′L3形成穩(wěn)定的異二聚體，二者相互協(xié)同，共同促進RNA的甲基化修飾[3,5]。m6A甲基化修飾過程是動態(tài)可逆的，通過去甲基化酶FTO或ALKBH5的去甲基化作用實現(xiàn)，為METTL14介導的HSC的活化提供了更多的干預靶點。目前關(guān)于METTL14調(diào)控疾病的分子機制主要集中在腫瘤領(lǐng)域[13,14]。本研究揭示了METTL14在肝纖維化中的重要作用，即高水平的METTL14促進HSC增殖及COL I和α-SMA的表達。

今后應開展體內(nèi)實驗進一步明確METTL14的表達與肝纖維化的關(guān)系，以及METTL14修飾差異的核心調(diào)控基因及其在肝纖維化中調(diào)控作用和機制。本研究證明了METTL14促進HSC的活化是肝纖維化進展的重要機制，為抗纖維化的治療提供了新的靶點。