洪曉綠 徐沛演 潘小平

乙型肝炎病毒(HBV)感染是一個重要的全球衛(wèi)生問題，特別是在發(fā)展中國家，有較高的發(fā)病率和病死率，我國HBV感染率約為7.18%[1-2]。HBV自身的感染力與宿主之間的相互作用對HBV的感染、復制和病情進展均有顯著影響，宿主中的某些基因可能對HBV感染的結局起關鍵性作用，與藥物代謝相關的基因如細胞色素P450(CYP)酶可能在乙型肝炎的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[3-5]。雖然CYP基因分型在肝細胞癌(HCC)中的作用比較明確，但CYP2E1和CYP1A1基因分型在HBV感染患者中的生物學作用還不甚明了。本研究分析CYP2E1 和 CYP1A1基因分型與廣州北部地區(qū)人群HBV易感性間的相關性，為HBV的檢測、診斷、預防提供新的實驗依據(jù)。

資料與方法

一、臨床資料

隨機選取2019年11月1日至2020年1月31日在廣州市花都區(qū)人民醫(yī)院就診的HBV感染者150例作為實驗組，男性96例，女性54例，年齡為(40.2±12.9)歲；另外選取同期體檢健康人群150名作為對照組，男性105名，女性45名，年齡為(30.8±10.1)歲，兩組年齡差異無統(tǒng)計學意義(t=2.492，P=0.271)。

納入標準：所有病例均符合2015年中華醫(yī)學會肝病學分會及感染病學分會制定的《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》診斷標準[6]，并結合癥狀、體征及實驗室影像學檢查，符合其診斷標準，健康體檢志愿者未攜帶肝炎病毒。

排除標準：①與其他病毒性肝炎重疊感染者；②合并其他慢性肝病者，③合并肝惡性腫瘤或其他臟器惡性腫瘤者；④其他重要臟器功能不全者。本研究經(jīng)本院倫理委員會審核批準且所有受試對象均獲得知情同意。

二、方法

(一)標本采集及處理 采集實驗組所有受試者清晨空腹靜脈血5 mL，取2 mL置于EDTA抗凝管中，按照DNA提取試劑盒(DP705-01，北京天根)提取DNA，紫外分光光度儀測定其A260/A280值1.7～1.9，剩余3 mL靜脈血置于干燥管中，3 500 r/min離心10 min，分離血清檢測ALT、AST、GGT、TBil、AFP、HBV DNA；按上述方法提取對照組所有受試者DNA，紫外分光光度儀檢測DNA純度。

(二)PCR擴增 采用Beacon Designer8軟件設計引物序列見表1，由上海生工生物工程有限公司合成，在PCR儀(2720 thermal cycler，ABI)上擴增。50 μL反應體系為DNA 1 μL、TSINGKE Mix 45 μL、引物F 2 μL、引物R 2 μL。擴增條件：98 ℃ 2 min，然后98 ℃ 10 s；60 ℃ 10 s；72 ℃ 10 s，共35個循環(huán)，72 ℃ 5 min。2 μL樣品+6 μL溴酚藍(B8120，Solarbio)混合后0.8%瓊脂糖電泳(300 V，12 min)，各目的片段條帶清晰，片段大小相符；采用PCR產(chǎn)物純化(磁珠法)試劑盒(DP219-03，北京天根)純化PCR擴增產(chǎn)物。

表1 rs3813867、rs2031920、rs4646421、rs2198843擴增引物序列

(三)SnapShot法檢測 SNP單鏈延伸所需的中間引物見表2。將5 μL反應體系(純化后的PCR產(chǎn)物1 μL， SnapShot multiplex Mix 2 μL，Primer Mix 2 μL)，于PCR儀(2720 thermal cycler，ABI)上擴增，反應條件：96 ℃ 10 s；50 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s共25個循環(huán)，4 ℃延伸保存。取1 μL擴增產(chǎn)物，加入10 μL 120Liz HIDI (00815746，ABI)，95 ℃變性5 min，-20 ℃冷卻2～3 min，采用測序儀(3730XL，ABI)檢測，Genemapper4.0分析結果。

表2 rs3813867、rs2031920、rs4646421、rs2198843單鏈延伸引物

三、統(tǒng)計學方法

兩組各基因型均進行Hardy-Weinberg檢驗，計算各組等位基因型分布頻率，組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、各基因型Hardy-Weinberg檢驗

根據(jù)Hardy-Weinberg平衡定律公式：[p(A)+q(a)]2=p2(AA)+2pq(Aa)+q2(aa)，計算H-W期望值，然后經(jīng)χ2檢驗，結果顯示，所有基因型P>0.05，所有基因型均符合哈代-溫伯格定律，具備群體代表性。見表3。

表3 rs3813867、rs2031920、rs4646421、rs2198843基因型Hardy-Weinberg檢測

二、兩組間基因型分布頻率比較

CYP2E1基因rs3813867 GG、GC、CC 3種基因型，rs2031920 CC、CT、TT 3種基因型的分布頻率在實驗組和對照組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；實驗組rs3813867基因CC基因型和rs2031920基因TT型分布高于對照組且差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。而CYP1A1基因rs4646421 GG、GA、AA 3種基因型和rs2198843 GG、GC、CC 3種基因型的分布頻率在兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表4。

表4 兩組間rs3813867、rs2031920、rs4646421、rs2198843基因型分布頻率比較

三、不同臨床指標時CYP2E1基因rs3813867和rs2031920基因型分布頻率

在各臨床指標中，CYP2E1基因rs3813867和rs2031920基因型分布頻率差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表5。

表5 不同臨床指標時CYP2E1基因rs3813867和rs2031920等位基因分布頻率

討 論

CYP450酶系屬于單加氧酶，主要存在于質(zhì)膜、線粒體、高爾基體、過氧化物酶體、核膜等細胞器的膜中，具有解毒作用，與藥物代謝密切相關[7]。CYP450酶是一組由許多同工酶組成的超基因大家族，以鐵卟啉為輔基，主要分布于肝臟，人類編碼CYP450的基因有18個基因家族，43個亞家族，57個基因[8]。

細胞色素P4502E1(CYP2E1)酶和CYP1A1酶是CYP 450酶超家族成員，對許多有毒物質(zhì)的代謝起重要作用，其均表達于肝臟，是肝臟中主要的CYP450亞型[9-10]。CYP2E1基因有多種變異體，這些變異體與多種不同類型癌癥的易感性增加或降低有關，如鼻咽癌[11]、膀胱癌[12]、肺癌[13]等；CYP2E1基因變異體(rs3813867 和 rs2031920)與鱗狀細胞癌[14]、結直腸癌密切相關[15]；CYP1A1酶是催化多環(huán)芳烴(PAHs)代謝所必需的酶，其兩個基因變異體與吸煙者肝癌的風險有關[16-17]，在HBV易感人群中鮮見報道。

本研究對150例HBV感染者和150例健康對照組CYP2E1和CYP1A1基因rs3813867、rs2031920、rs4646421、rs2198843的多態(tài)性進行了研究，結果表明，CYP1A1基因rs4646421和rs2198843基因型分布頻率在HBV感染者與健康對照組間差異無統(tǒng)計學意義。通過對CYP2E1基因rs3813867基因型分析發(fā)現(xiàn)，HBV感染者CC基因型分布頻率高于健康對照組，CC基因型個體的肝炎發(fā)展風險是GG基因型個體的5.59倍，而CYP2E1基因rs2031920 TT基因型分布頻率HBV感染者高于健康對照組，TT基因型個體的肝炎發(fā)展風險是CC基因型個體的3.57倍。本研究與Fattahi等[18]的研究結論不一致，其原因可能為研究的人群不同，攜帶的基因型以及基因分布頻率不同。

Nakai等[19]發(fā)現(xiàn)，慢性丙型肝炎感染與藥物代謝酶如CYP1A2、CYP2E1和CYP3A4有關。Makpol等[20]研究提示馬來西亞人群中CYP1A1基因變異與肝癌風險之間存在顯著關系。Yu等[21]研究表明CYP1A1變異在多環(huán)芳烴的致癌作用中起重要作用。Li等[16]研究表明rs2198843和rs46464233變異攜帶者有較高的肝癌風險。而本研究表明，rs3813867位點有CC基因型，rs2031920有TT基因型的個體更易感染HBV。

綜上所述，CYP1A1基因rs4646421和rs2198843位點基因分型與廣州北部地區(qū)人群HBV易感性無關，CYP2E1基因rs3813867和rs4646421位點基因分型與廣州北部地區(qū)人群HBV易感性密切相關。