方瑋婷，張媛媛，秦貽，陳竹

類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種以累及外周關(guān)節(jié)為主、以慢性侵蝕性滑膜炎為特征的系統(tǒng)性自身免疫性疾病[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，固有免疫系統(tǒng)參與了RA的發(fā)病機制[2]。固有淋巴細胞(innate lymphoid cells, ILC)是近年來發(fā)現(xiàn)的一群參與固有免疫的異質(zhì)性淋巴細胞, 多位于黏膜屏障部位，接受局部微環(huán)境細胞因子的信號，通過分泌細胞因子及其他介質(zhì)，發(fā)揮早期的免疫監(jiān)控和免疫調(diào)節(jié)作用。基于分泌的細胞因子及所表達轉(zhuǎn)錄因子的不同，將其分為3大亞群，分別為ILC1群(包括NK細胞和ILC1，表達T-bet、Eomes和NFIL3，產(chǎn)生IFN-γ)、ILC2群(ILC2，表達Gata3，產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-13等細胞因子)和ILC3群(包括LTi和ILC3，表達RORγt，產(chǎn)生IL-17、IL-22和CM-CSF)[3]。近期研究發(fā)現(xiàn)，人體外周血存在ILC前體細胞(innate lymphoid cell precursors, ILCP)，可在體內(nèi)和體外分化為ILC亞群[4]。越來越多的證據(jù)表明，ILC亞群可作為抗原呈遞細胞，啟動輔助型T細胞(Th)下游的免疫反應(yīng)[3]。

研究發(fā)現(xiàn)，ILCs參與多種自身免疫性和炎癥性疾病，如炎癥性腸病、多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性硬化癥、ANCA相關(guān)性血管炎和RA的發(fā)生發(fā)展[2]。與Th1和Th17在RA中的致病效應(yīng)相一致的是，ILC1和ILC3被認為在RA中發(fā)揮促炎作用，但相關(guān)研究結(jié)果不一致[2]。與此相反，ILC2可能在RA中具有抑制炎癥的效應(yīng)。在RA患者和小鼠關(guān)節(jié)炎研究中發(fā)現(xiàn)，活動期RA患者外周血ILC2數(shù)量減少，ILC2缺陷的小鼠關(guān)節(jié)炎明顯加重，而活化ILC2可改善實驗小鼠的關(guān)節(jié)炎[5-6]。目前ILCP和ILC其他亞群在RA中的臨床意義尚不明確，本研究旨在分析ILCP和ILC各亞群在RA外周血的水平以及與臨床和實驗室指標的相關(guān)性，初步探討其在RA發(fā)病機制中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年9月至2021年2月就診于安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院風濕免疫科門診及住院的RA患者60例，所有患者診斷均滿足1987/2010年RA分類標準。詳細記錄患者的基本信息(性別、年齡及病程)、臨床特征 [腫脹關(guān)節(jié)數(shù)(SJC)、壓痛關(guān)節(jié)數(shù)(TJC)、疾病活動評分DAS28]、實驗室檢查 [血沉(ESR)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)、類風濕因子(RF)、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(Anti-CCP)]及治療情況。根據(jù)DAS28評分，將RA患者分為穩(wěn)定組(DAS28≤3.2，29例)和活動組(DAS28>3.2，31例)。納入同期在醫(yī)院體檢中心體檢的性別年齡匹配，且排除免疫相關(guān)疾病的健康對照者32例。所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 ILC亞群檢測

空腹抽取兩組對象5mL外周抗凝血，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離獲得外周血單核細胞(peri-pheral blood monouclear cells, PBMC)懸液并計數(shù)。取200 μL PBMC懸液，加入熒光抗體APC/Cy7-FVS、FITC-Lin(CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56)、BV510-CD45、PerCP-CD127、PE/Cy7-CRTH2、BV421-CD117、APC-NKp44、AF700-CD161(均來自美國Biolegend)，避光孵育30 min后，磷酸鹽緩釋液(PBS)洗滌，加300 μL PBS重懸，流式細胞儀上機檢測ILC細胞比例(BD Canto Ⅱ)。

1.3 統(tǒng)計學分析

正態(tài)分布連續(xù)性變量采用(均值±標準差)表示，定量資料比較應(yīng)用單因素方差分析、Mann-WhitneyU檢驗及Kruskal-WallisH檢驗，流式數(shù)據(jù)采用Flowjo V10軟件分析，使用GraphPad Prism 6進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計作圖，所有資料用SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 RA患者臨床資料

活動組患者RF、SJC、TJC、ESR、CRP、DAS28明顯高于穩(wěn)定組患者，差異有統(tǒng)計學意義。兩組患者性別比、平均年齡、病程、抗CCP抗體滴度及用藥情況差異無統(tǒng)計學意義(表1)。

表1 RA患者臨床資料Table 1 Clinical data of patients with RA

2.2 ILCs亞群的比例

三組實驗對象外周血總ILCs、ILCP和ILC亞群(圖1A)百分比比較：(1)活動組RA患者外周血總ILCs(FVS-CD45+Lin-CD127+)占CD45+細胞百分比高于對照組[(0.42±0.44)%比(0.24±0.11)%,P=0.014 1]，穩(wěn)定組RA患者總ILCs與對照組百分比相當，差異無統(tǒng)計學意義(圖1B)。(2)活動組RA患者ILCP(FVS-CD45+Lin-CD127+CD117+)占總ILC百分比低于對照組[(6.05±4.96)%比(8.78±4.77)%,P=0.0324]和穩(wěn)定組RA患者[(6.05±4.96)%比(9.12±5.44)%,P=0.0286]，穩(wěn)定組RA與對照組差異無統(tǒng)計學意義(圖1C)。(3)活動組RA患者ILC1(CRTH2-CD117-)占總ILC百分比高于穩(wěn)定組RA患者[(87.99±8.00)%比(81.43±7.06),P=0.0017]和對照組[(87.99±8.00)%比(82.35±7.09)%,P=0.005]，而ILC2(CRTH2+CD117-)占總ILC百分比顯著低于穩(wěn)定組RA[(8.43±6.18)%比(13.14±6.62),P=0.0069]和對照組[(8.43±6.18)%比(12.21±5.83)%,P=0.017 1]。穩(wěn)定組RA患者ILC1和ILC2百分比與對照組差異無統(tǒng)計學意義(圖1D、E)?；顒咏MRA患者ILC3(CRTH2-CD117+)占總ILC百分比低于對照組[(3.49±2.79)%比(5.35±3.62)%,P=0.047 2]，穩(wěn)定組RA與對照組之間無明顯差異(圖1F)。

圖 1 RA患者外周血ILC亞群細胞

2.3 ILCs亞群與臨床和實驗室指標間的相關(guān)性

相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，RA患者外周血總ILCs和ILC1與DAS28呈正相關(guān)(P<0.05)，而ILCP、ILC2和ILC3與DAS28呈負相關(guān)(P<0.05)；ILC1與TJC和ESR呈正相關(guān)(P<0.05)，而ILCP和ILC3與ESR(P<0.05)和抗CCP抗體(P<0.05)呈負相關(guān)(P<0.05)。余臨床和實驗室指標與ILC亞群無明顯相關(guān)性(表2)。

表2 ILCs亞群與臨床和實驗室指標間的相關(guān)性Table 2 Correlation of ILC subsets with clinical and laboratory parameters

2.4 ILCs亞群與其他免疫細胞間的相關(guān)性

進一步分析RA患者外周血CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD19+B細胞和調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)的比例，發(fā)現(xiàn)ILCP和ILC3與Treg呈正相關(guān)(P<0.05)，而ILC2與CD19+B細胞呈負相關(guān)(P<0.05)(表3)。

表3 ILCs亞群與其他免疫細胞間的相關(guān)性Table 3 The association of ILC subsets with other immune cell populations

3 討論

越來越多的證據(jù)表明，ILCs參與多種炎癥性關(guān)節(jié)病的發(fā)展。早期研究發(fā)現(xiàn)，RA患者關(guān)節(jié)液中ILC3明顯升高，可產(chǎn)生IL-22和TNF-α，且與疾病活動呈正相關(guān)[7]。另一項在日本RA患者的研究結(jié)果[8]與之相似。Leijten等[9]報道，與銀屑病關(guān)節(jié)炎(psoriatic arthritis,PsA)不同，RA患者關(guān)節(jié)液中ILC1是主要的ILC亞群。另一項研究發(fā)現(xiàn)，幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)液中ILC1和ILC3均明顯擴增，且ILC3的比例與臨床特征呈正相關(guān)[10]。上述研究結(jié)果不一致可能與不同的研究入選患者的疾病活動狀態(tài)、ILC設(shè)門策略各異有關(guān)。

本研究檢測RA患者和健康對照者外周血ILCs各亞群的百分比，根據(jù)RA患者DAS28分為活動組和穩(wěn)定組，分析其與患者臨床表現(xiàn)、實驗室檢查及其他免疫細胞等的相關(guān)性，初步探討其在RA發(fā)病中的作用。發(fā)現(xiàn)活動組RA患者總ILCs和ILC1百分比高于健康對照者，而ILC3百分比低于健康對照者。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，外周血總ILCs和ILC1與DAS28呈正相關(guān)，而ILC3與DAS28呈負相關(guān)，提示ILC1可能參與了 RA患者的發(fā)病過程。Rosser等[10]報道，幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎ILC1、ILC3在患者的滑膜液中均有擴增，其中NKp44- ILC3與臨床特征呈正相關(guān)。另一項研究發(fā)現(xiàn)，日本RA人群中CCR6+ILC3在患者滑膜液中的比例與TJC、SJC正相關(guān)，且是IL-17和IL-22的主要來源[8]。本研究ILC3分布與上述文獻不一致，可能與不同研究對ILC3表面分子標記的定義、患者人種及病情活動性、用藥情況等存在差異有關(guān)。

與ILC1和ILC3的促炎作用不同，ILC2被認為在關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮抑炎效應(yīng)。Omata等[11]報道，ILC2在穩(wěn)定期RA患者的外周血及滑液中增多，且與疾病活動度呈負相關(guān)。進一步動物實驗結(jié)果表明，ILC2可能通過分泌IL-4/IL-13抑制TNF-α和IL-1β的效應(yīng)而發(fā)揮緩解關(guān)節(jié)炎癥及骨破壞的作用。與前期報道[6, 11]一致的是，本研究也發(fā)現(xiàn)RA活動組ILC2低于穩(wěn)定組和健康對照組，且與疾病活動指數(shù)呈負相關(guān)，提示ILC2減少和(或)功能障礙參與了RA的發(fā)病。筆者近期研究還發(fā)現(xiàn)，小分子肽神經(jīng)介素U可通過活化ILC2緩解膠原誘導的關(guān)節(jié)炎，提示調(diào)控ILC2活化促進關(guān)節(jié)炎緩解有望成為RA治療的新策略[5]。

最近有研究發(fā)現(xiàn)人外周血存在CD117+ILCP，可在體內(nèi)和體外產(chǎn)生所有的ILC亞群[4]。盡管調(diào)控ILCP分化成ILC亞群的機制尚不明確，但普遍認為其最終分化是在組織內(nèi)[4]。目前ILCP在炎癥性關(guān)節(jié)病中的意義尚不明確。本研究顯示活動組RA患者外周血ILCP較穩(wěn)定組和健康對照組明顯減少，而穩(wěn)定組患者和健康對照組無明顯差異；與此同時，活動組患者ILC1百分比升高，提示ILCP可能通過遷移到炎癥部位分化為ILC1發(fā)揮致炎效應(yīng)。本研究RA活動組ILC3百分比低于健康對照組，但與穩(wěn)定期RA患者之間沒有差異，不排除ILC3因為較強的異質(zhì)性和可塑性，從而向ILC1轉(zhuǎn)換的可能性[12]。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)ILCP和ILC亞群在RA患者外周血中分布失衡，且與疾病活動度、部分實驗室指標及免疫學指標相關(guān)。雖然目前ILC在RA中的發(fā)病機制尚不明確，但現(xiàn)有的研究提示調(diào)控某些ILC亞群能為未來RA的免疫治療提供可能。本研究仍存在一定的局限性。首先，患者來源于單中心，初發(fā)未治療的患者較少，可能存在某些治療藥物對ILC的影響。其次，本研究為觀察性橫斷面研究，尚未有足夠的治療前后對比研究，也限制了其在發(fā)病機制中作用的深層次探究。