趙慧敏，張丹丹，陳晴，秦凌鈺，何韶衡

過(guò)敏性疾病是一個(gè)全球公共衛(wèi)生問(wèn)題，屋塵螨(dust mite)是引起全世界過(guò)敏性疾病的主要原因之一。最近研究表明，治愈過(guò)敏性疾病的特異性免疫療法由于不良反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)限制了其廣泛應(yīng)用，使用純化或重組過(guò)敏原可以提高治療療效以及安全性。并且，過(guò)敏原組分的單一性是新一代脫敏治療候選藥物的基本要求[1-4]。因此，從復(fù)雜的實(shí)際屋塵螨樣本中分離出單一組分的過(guò)敏原蛋白Der p1是進(jìn)行臨床過(guò)敏性疾病診斷和治療的關(guān)鍵。本研究使用PBS-T溶液對(duì)屋塵螨干粉中的過(guò)敏原蛋白進(jìn)行粗提取，利用陽(yáng)離子交換層析對(duì)粗提取液中的Der p1進(jìn)行分離純化，通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對(duì)純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，為臨床過(guò)敏性疾病的診斷和治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

屋塵螨干粉樣本由錦州市錦州醫(yī)科大學(xué)提供。

1.2 主要儀器與試劑

單盤電子天平(北京賽多利斯儀器有限公司，中國(guó))；Azure C300化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Azure，美國(guó))；高速冷凍離心機(jī)ST16R(Thermo Scientific，德國(guó))；GE AKTA Pure蛋白質(zhì)層析純化系統(tǒng)(General Electric Company，美國(guó))；桌上中試型凍干機(jī)Lyobeta mini(Telstar，西班牙)；高效液相色譜Waters Alliance HPLC(Waters，Belgium)；Mini-PROTEAN Tetra小型垂直電泳槽(Bio-Rad，美國(guó))；Cascada III I全新智能純水/超純水一體化系統(tǒng)(Pall，美國(guó))；甘氨酸、四甲基乙二胺(TEMED)、過(guò)硫酸銨(APS)、丙烯酰胺、N, N-亞甲基二丙烯酰胺、考馬斯亮藍(lán)R-250、KH2PO4、NH4HCO3和十二烷基硫酸鈉(SDS)(國(guó)藥集團(tuán)，上海，中國(guó))；蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(Takara生物技術(shù)有限公司，大連，中國(guó))；磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution，PBS)-0.05 % Tween-20(簡(jiǎn)稱 PBS-T)購(gòu)自于Takara 生物技術(shù)有限公司(大連，中國(guó))。

1.3 屋塵螨粗提液提取

稱量屋塵螨干粉0.10 g，加入到20 mL PBS-T溶液中，4 ℃下攪拌過(guò)夜，5 000×g離心屋塵螨混懸液20 min取上清液，加入25 mmol/L pH 4.5醋酸鈉緩沖溶液20 mL后進(jìn)行透析，在4 ℃下透析3～4 d。透析完成后，4 ℃保存。

1.4 屋塵螨過(guò)敏蛋白Der p1分離純化

結(jié)合液A：pH 4.5 25 mmol/L醋酸鈉緩沖液，洗脫液B：1.0 mol/L NaCl溶液。首先用20%乙醇清洗系統(tǒng)泵，然后將陽(yáng)離子交換層析柱HiTrap Capto MMC連接到AKTA pure儀器上，再用結(jié)合液A清洗樣品泵，然后用2個(gè)柱體積 A平衡柱子。通過(guò)樣品泵上樣，進(jìn)樣體積為1 mL，進(jìn)樣5 min后，用1個(gè)柱體積結(jié)合液A清洗柱子，然后使用30% B對(duì)柱子進(jìn)行梯度洗脫，沖洗10個(gè)柱體積，洗脫完成后，使用A平衡柱子，平衡5個(gè)柱體積。

1.5 屋塵螨過(guò)敏蛋白Der p1鑒定

采用SDS-PAGE對(duì)各組分蛋白進(jìn)行分析鑒定。12%分離膠和5%濃縮膠對(duì)屋塵螨粗提液和經(jīng)陽(yáng)離子交換層析分離后蛋白組分進(jìn)行電泳分析，電泳凝膠用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液進(jìn)行染色，脫色后用凝膠電泳成像系統(tǒng)分析并進(jìn)行圖像采集，與蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)后確定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量。

2 結(jié)果

2.1 屋塵螨粗提液的SDS-PAGE

屋塵螨粗提液中有很多條蛋白區(qū)帶，其中相對(duì)分子質(zhì)量25 000為主要過(guò)敏原蛋白(圖1)。

圖 1 屋塵螨粗提液主要蛋白質(zhì)分布Fig 1 SDS-PAGE of major proteins in crude extract of dust mite1：蛋白marker； 2：屋塵螨提取液Mr:相對(duì)分子質(zhì)量

2.2 Der p1的分離純化

2.2.1 屋塵螨粗提液陽(yáng)離子交換層析

屋塵螨粗提液的陽(yáng)離子交換層析結(jié)果如圖2所示，其中Ⅲ峰為含有目標(biāo)過(guò)敏原蛋白Der p1的收集峰。

圖 2 陽(yáng)離子交換層析色譜結(jié)果Fig 2 Result of cation exchange chromatography

2.2.2 SDS-PAGE分析

將圖2所示Ⅰ～Ⅴ號(hào)5個(gè)收集液進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果Lane 3對(duì)應(yīng)的Ⅲ收集液SDS-PAGE可見明顯相對(duì)分子質(zhì)量為25 000的蛋白條帶(圖3)，即目標(biāo)過(guò)敏原蛋白Der p1。

圖 3 陽(yáng)離子交換層析SDS-PAGE結(jié)果Fig 3 SDS-PAGE results of cation exchange chromatography0:蛋白Marker; 1～5分別對(duì)應(yīng)Ⅰ～Ⅴ號(hào)收集液的蛋白條帶Mr:相對(duì)分子質(zhì)量

3 討論

屋塵螨可導(dǎo)致過(guò)敏性哮喘、鼻炎等呼吸系統(tǒng)過(guò)敏性疾病，2004年，世界衛(wèi)生組織估計(jì)全球約有3億哮喘和鼻炎患者，并呈上升趨勢(shì)[5-7]。

采用蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合藥理學(xué)手段，可識(shí)別出屋塵螨中近幾十種過(guò)敏原，其中，Der p1 是屋塵螨的主要過(guò)敏原之一[8-9]。在室內(nèi)塵土中Der p1的含量大概為0.02～14.30 μg/g，Der p1的氨基酸個(gè)數(shù)為320，是相對(duì)分子量為25 000的糖蛋白，等電點(diǎn)4.7～7.4。Der p1由兩個(gè)球狀單體組成，兩個(gè)單體重合面大，是一種緊密的雙層蛋白。在Der p1的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，43.75%為α螺旋結(jié)構(gòu)，作為木瓜蛋白酶家族成員，包含了組氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和鎂結(jié)合位點(diǎn)等活性位點(diǎn)，在與后期產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)的過(guò)程中起到關(guān)鍵作用[10-12]。目前認(rèn)為作為氣道首要防線的支氣管上皮細(xì)胞在受到過(guò)敏原或病毒等有害因素反復(fù)刺激時(shí)，可通過(guò)分泌一系列細(xì)胞因子、趨化因子及黏附分子等炎性介質(zhì)與自身細(xì)胞及其他氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞、炎性細(xì)胞相互作用，參與哮喘的氣道慢性炎癥過(guò)程。有研究表明 Der p1的抗原暴露可直接引起氣道上皮損傷及脫落，而由屋屋塵螨抗原導(dǎo)致上皮細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)上調(diào)，可能是過(guò)敏原誘發(fā)哮喘或使哮喘加重的原因之一[13]。因此，從復(fù)雜的實(shí)際屋塵螨樣本中分離出單一組分的過(guò)敏原蛋白是研究誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵，可實(shí)現(xiàn)對(duì)屋塵螨過(guò)敏患者特異性的診斷與治療。

本研究旨在對(duì)屋塵螨粗提液中的過(guò)敏原蛋白Der p1進(jìn)行分離純化。首先采用PBS-T溶液作為提取液對(duì)屋塵螨中的過(guò)敏原蛋白進(jìn)行粗提取，然后利用陽(yáng)離子交換層析對(duì)屋塵螨粗提液進(jìn)行初步的分離純化。結(jié)果表明，通過(guò)采用PBS-T溶液對(duì)屋塵螨中的過(guò)敏原蛋白進(jìn)行粗提取，利用25 mmol/L pH 4.5的醋酸鈉緩沖溶液對(duì)其進(jìn)行透析，屋塵螨粗提液中目標(biāo)過(guò)敏原蛋白Der p1含量最高(相對(duì)分子質(zhì)量25 000)，而其他蛋白質(zhì)含量較少，此操作綠色溫和、簡(jiǎn)單易行，并且蛋白質(zhì)不易降解。陽(yáng)離子交換層析結(jié)果表明，目標(biāo)過(guò)敏原蛋白Der p1主要分布在Ⅲ峰，SDS-PAGE結(jié)果表明，Ⅲ峰中對(duì)應(yīng)的過(guò)敏原蛋白與國(guó)內(nèi)外報(bào)道的Der p1相對(duì)分子質(zhì)量25 000相一致。分離純化出來(lái)的Der p1具有為重組過(guò)敏原、設(shè)計(jì)低過(guò)敏衍生物以及預(yù)防性疫苗接種提供依據(jù)的潛在價(jià)值，還有望開發(fā)新一代脫敏治療候選藥物，將為臨床屋塵螨過(guò)敏性疾病的診斷和治療奠定基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)研究，利用陽(yáng)離子交換層析對(duì)屋塵螨粗提液進(jìn)行純化，成功分離出目標(biāo)過(guò)敏原蛋白Der p1。