黃 靜，李長田，賈傳文，王曉敏，呂瑞娜

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食藥用菌教育部工程研究中心，吉林 長春 130118）

金針菇是我國主要的工廠化栽培食用菌之一，栽培范圍廣、產(chǎn)量大[1]。但在栽培過程中各類病害也經(jīng)常發(fā)生，其中綿腐病（軟腐?。┦浅Ｒ姷牟『χ籟2-3]。其致病菌是異型葡枝霉（Cladobotryum varium），為金黃菌寄生菌Hypomyces aurantius（Pers.）Tulasne的無性型[4]。在上世紀(jì)90年代中期金針菇常規(guī)生產(chǎn)中第一次出現(xiàn)綿腐病，普遍分布于我國南部和北部溫帶地區(qū)[5]。近年來，隨著栽培品種及氣候條件的不斷變化，綿腐病成為金針菇常規(guī)栽培和工廠化栽培的常見病害，對金針菇品質(zhì)及產(chǎn)量造成嚴(yán)重影響。

異型葡枝霉以孢子形式侵染金針菇子實(shí)體；子實(shí)體感染初期由白色菌絲從子實(shí)體上吸取營養(yǎng)擴(kuò)繁，致使菌柄變軟倒伏、后期變黃變黑至腐爛[6-8]。金針菇生長發(fā)育的各個(gè)時(shí)期均可被侵染，其中搔菌到出芽階段最易受侵染[9]。目前，對該病菌的防治主要依靠噴施殺菌劑，但長期使用會(huì)使異型葡枝霉的抗藥性增強(qiáng)且造成環(huán)境污染并增加生產(chǎn)成本，同時(shí)降低了金針菇鮮品品質(zhì)[10-11]。

在逆境條件下，植物產(chǎn)生的活性氧自由基會(huì)破壞自身細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，進(jìn)而影響其正常生長發(fā)育，同時(shí)在逆境條件下植物體內(nèi)存在的酶保護(hù)系統(tǒng)即抗氧化酶系統(tǒng)被激活可將其體內(nèi)多余的自由基消除[12]。病原菌與寄主相互競爭與相互識別的過程中，寄主體內(nèi)被迫產(chǎn)生高于正常水平的活性氧，打亂了正常代謝功能。過氧化物酶、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶共同組成體內(nèi)有效的活性氧清除系統(tǒng)，三者協(xié)同作用，可有效地清除植物體內(nèi)過氧化物和自由基[13]。多酚氧化酶可將酚類物質(zhì)氧化為對病原菌有毒的醌類物質(zhì)，和植物的抗病性關(guān)聯(lián)密切，苯丙氨酸解氨酶是苯丙烷類代謝途徑中的限速酶和關(guān)鍵酶，為合成木質(zhì)素和植保素提供前體，因此被作為植物抗病性的一個(gè)生化指標(biāo)[14-15]。

目前，對綿腐病的研究主要集中在發(fā)生環(huán)境、生物學(xué)特性及防治等方面[16-17]，而對金針菇抗性機(jī)制方面卻缺少系統(tǒng)性研究。選育對異型葡枝霉具強(qiáng)抗性的金針菇品種是防治病害發(fā)生的最有效方法之一，因此深入研究金針菇的抗性機(jī)制具有重要意義。結(jié)合植物的抗病機(jī)制，試驗(yàn)從病原物與寄主互作的角度出發(fā)，研究寄主被侵染后不同金針菇品種與4種防御系酶活性變化的關(guān)系，以期為金針菇抗病品種選育中生理生化指標(biāo)的確定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試品種

金針菇L3002、L3003、L3005菌株來源于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食（藥）用菌教育部工程研究菌種保藏中心，病原菌異型葡枝霉（Cladobotryum varium）JZ-01為長春高榕公司金針菇菇房中具典型病狀的子實(shí)體分離所得，經(jīng)柯赫氏法則驗(yàn)證[18]，現(xiàn)保存于菌種保藏試驗(yàn)室。

1.2 異型葡枝霉菌懸液的制備

異型葡枝霉菌絲24℃暗光培養(yǎng)5 d，表面產(chǎn)生大量孢子后，用移液槍吸取無菌水置于培養(yǎng)皿內(nèi)，多次吸打。后吸取1 mL孢子懸濁液于9 mL的無菌蒸餾水中，混勻，后取1 mL于9 mL無菌蒸餾水中，反復(fù)此操作，直至血球計(jì)數(shù)板檢測菌懸液的濃度為1×106個(gè)/mL[19]。

1.3 接種及取樣

按金針菇工廠化的操作流程進(jìn)行栽培及出菇管理[20]，在金針菇子實(shí)體長至瓶口時(shí)將配制好的異型葡枝霉菌懸液以噴霧式接種于金針菇柄部，以無菌水處理為對照，于接種第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天取樣后立即放入液氮中，移入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 粗酶液提取與測定

采用試劑盒法（南京建成生物工程研究所：過氧化物酶試劑盒，多酚氧化酶試劑盒，苯丙氨酸解氨酶試劑盒，超氧化物歧化酶試劑盒）對4種酶進(jìn)行測定，檢測方法按試劑盒說明書操作，每次測定重復(fù)3次取平均值。

1.5 數(shù)據(jù)分析

記錄所得的數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，將不同處理所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素顯著性分析，設(shè)定顯著性水平P為0.05，均值間不同小寫字母表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 異型葡枝霉侵染不同金針菇子實(shí)體后PAL的活性變化

不同金針菇子實(shí)體苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）活性變化見表1、圖1。

圖1 不同金針菇子實(shí)體的PAL活性變化Fig.1 Changes of PAL activity in different Flammulina filiformis fruiting bodies

表1 不同金針菇子實(shí)體的PAL活性變化Tab.1 Changes of PAL activity in different Flammulina filiformis fruiting bodies

由表1、圖1所示，接種病原菌后，不同金針菇菌株的子實(shí)體內(nèi)苯丙氨酸解氨酶PAL的活性均呈上升趨勢，且不同菌株上升趨勢不同。達(dá)到峰值的時(shí)間也不同。L3005的PAL最大峰值高于L3002和L3003。L3005的PAL酶活性在第5天時(shí)達(dá)到最大峰值，隨后PAL活性逐漸下降，L3005的PAL活性波動(dòng)最大，最大酶活為 44.32 U·g-1min-1，是未接種時(shí)的3倍；L3003的PAL活性在第4天達(dá)到峰值為42.83 U·g-1min-1，是未接種的2.6倍；L3002的PAL活性波動(dòng)最小，在第3天達(dá)到峰值其活性是未接種時(shí)的2倍。3個(gè)不同金針菇菌株的子實(shí)體內(nèi)PAL活性與接種病原菌后的酶活性差異顯著（P＜0.05）。

2.2 異型葡枝霉侵染不同金針菇子實(shí)體后PPO的活性變化

異型葡枝霉侵染不同金針菇子實(shí)體后多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）的活性變化見表2、圖2。

表2 不同金針菇子實(shí)體的PPO活性變化Tab.2 Changes of PPO activity in different Flammulina filiformis fruiting bodies

圖2 不同金針菇子實(shí)體的PPO活性變化Fig.2 Changes of PPO activity in different Flammulina filiformis fruiting bodies

由表2、圖2可知，不同金針菇菌株未經(jīng)過接菌處理其子實(shí)體內(nèi)的多酚氧化酶活性變化不大。接種后，不同金針菇菌株子實(shí)體內(nèi)PPO酶活性均呈上升趨勢。接種病原菌后，L3005的PPO活性波動(dòng)最大，第3天就達(dá)到最大峰值，為 40.92 U·g-1min-1，是其對照的 3.2倍；L3002和 L3003的波動(dòng)相對較小。L3003的PPO活性第3天達(dá)到峰值 29.7 U·g-1min-1是其對照的 2.2 倍；L3002的 PPO活性第 4天達(dá)到峰值 27.72 U·g-1min-1，是其對照的1.89倍。接種處理后，3個(gè)金針菇品種子實(shí)體內(nèi)PPO活性與其對照的酶活性差異顯著（P＜0.05）。

2.3 異型葡枝霉侵染不同金針菇子實(shí)體后POD的活性變化

異型葡枝霉侵染不同金針菇子實(shí)體后過氧化物酶（peroxidase，POD）的活性變化見表3、圖3。

表3 不同金針菇子實(shí)體的POD活性變化Tab.3 Changes of POD activity in different Flammulina filiformis fruiting bodie

圖3 不同金針菇子實(shí)體的POD活性變化Fig.3 Changes of POD activity in different Flammulina filiformis fruiting bodies

由表3、圖3可知，金針菇未受病原菌侵染時(shí)，同一時(shí)期生長的3個(gè)菌株子實(shí)體內(nèi)的過氧化物酶酶活變化不大，在同一水平上波動(dòng)。接種病原菌后，金針菇子實(shí)體內(nèi)的酶活發(fā)生變化，均呈上升趨勢。其中L3005和L3003的POD活性均在第2天達(dá)到峰值，L3002在第3天達(dá)到峰值。L3005和L3002的POD活性波動(dòng)較大。L3005的最大酶活達(dá)到384.21 U·g-1min-1，是其對照的3.75倍；L3002的最大酶活為 341.57 U·g-1·min-1，是其對照的 3.17 倍；L3003 的POD活性波動(dòng)相對較小，最大酶活為304.37 U·g-1min-1，是其對照的2.63倍。接種處理后，不同金針菇品種子實(shí)體內(nèi)的POD活性與未接種處理的酶活性差異顯著 （P＜0.05）。

2.4 異型葡枝霉侵染不同金針菇子實(shí)體后SOD的活性變化

異型葡枝霉侵染不同金針菇子實(shí)體后超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性變化見表4、圖4。

圖4 不同金針菇子實(shí)體的SOD活性變化Fig.4 Changes of SOD activity in different Flammulina filiformis fruiting bodies

表4 不同金針菇子實(shí)體的SOD活性Tab.4 Changes of SOD activity in different Flammulina filiformis fruiting bodies

由表4、圖4可知，不同金針菇菌株體內(nèi)的SOD活性不同，波動(dòng)不大。接種病原菌后，金針菇子實(shí)體內(nèi)的SOD活性均呈上升趨勢。接種病原菌后，3個(gè)菌株均在3 d達(dá)到了最大峰值。且L3005的SOD活性偏高于L3002和L3003。L3005的SOD活性增幅最大，最大酶活為 729.63 U·g-1min-1，是其對照的 1.4倍；L3002 的最大酶活為 688.94 U·g-1min-1，是其對照的 1.3 倍；L3003 的最大酶活為674.91 U·g-1min-1，是其對照的1.26倍。接種處理后，3個(gè)金針菇菌株子實(shí)體內(nèi)SOD活性與未接種處理的酶活性差異性顯著 （P＜0.05）。

3 討論

當(dāng)生物被各類外源病原物侵染后，寄主細(xì)胞會(huì)調(diào)整自身體內(nèi)生理生化和組織結(jié)構(gòu)來適應(yīng)外源物刺激以達(dá)到生存的目的，其中以參與各種代謝的防御酶類的活性變化最為明顯[21]。苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）均屬于寄主防衛(wèi)系統(tǒng)的相關(guān)酶類，在某種程度上詮釋了寄主對病原菌的抗病程度，因此可以作為寄主抗病性的一個(gè)生理指標(biāo)[22]。

異型葡枝霉菌侵染金針菇后，激活金針菇體內(nèi)的主要防御酶系，使PAL、PPO、POD、SOD四種防御系酶的活性明顯增高。這與周春元[23]對雙孢蘑菇受濕泡病菌侵染后，雙孢蘑菇體內(nèi)的酶活性升高結(jié)果一致，也和大多前人對其他作物的研究結(jié)果一致[24-25]。接種異型葡枝霉菌后，相比對照未接種的3個(gè)金針菇菌株子實(shí)體內(nèi)的防御酶活性均有變化，出現(xiàn)最大峰值。其中，金針菇菌株L3005的PAL、PPO、POD、SOD活性均高于L3003和L3002。不同金針菇品種體內(nèi)防御酶活性變化不同，說明4種防御酶在不同金針菇品種受異型葡枝霉侵染的抗性機(jī)制中發(fā)揮了一定作用?？赏ㄟ^對不同金針菇品種防御酶活性的測定，為篩選金針菇抗性品種提供一定的科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

同一生長時(shí)期金針菇子實(shí)體體內(nèi)防御性酶活性差異不大，且酶活性波動(dòng)趨勢相同。接種病原菌后，金針菇體內(nèi)的酶活均有不同變化，且被病原菌侵染后一定時(shí)間內(nèi)4種防御性酶的活力值均可達(dá)到峰值。金針菇接入病原菌后，其體內(nèi)的酶活性與正常金針菇體內(nèi)的酶活性差異顯著（P＜0.05）。其中，金針菇L3005的酶活性變化幅度均大于L3002和L3003，其活力值也偏高于二者。即金針菇L3005品種對異型葡枝霉菌的抗性更強(qiáng)。表明金針菇棉腐病的抗性和防御酶系之間相連密切，產(chǎn)生峰值前后時(shí)間可以作為金針菇抗病性的一個(gè)重要生理生化指標(biāo)。