黃 靜,李長(zhǎng)田,賈傳文,王曉敏,呂瑞娜
(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食藥用菌教育部工程研究中心,吉林 長(zhǎng)春 130118)
金針菇是我國主要的工廠化栽培食用菌之一,栽培范圍廣、產(chǎn)量大[1]。但在栽培過程中各類病害也經(jīng)常發(fā)生,其中綿腐?。ㄜ浉。┦浅R姷牟『χ籟2-3]。其致病菌是異型葡枝霉(Cladobotryum varium),為金黃菌寄生菌Hypomyces aurantius(Pers.)Tulasne的無性型[4]。在上世紀(jì)90年代中期金針菇常規(guī)生產(chǎn)中第一次出現(xiàn)綿腐病,普遍分布于我國南部和北部溫帶地區(qū)[5]。近年來,隨著栽培品種及氣候條件的不斷變化,綿腐病成為金針菇常規(guī)栽培和工廠化栽培的常見病害,對(duì)金針菇品質(zhì)及產(chǎn)量造成嚴(yán)重影響。
異型葡枝霉以孢子形式侵染金針菇子實(shí)體;子實(shí)體感染初期由白色菌絲從子實(shí)體上吸取營(yíng)養(yǎng)擴(kuò)繁,致使菌柄變軟倒伏、后期變黃變黑至腐爛[6-8]。金針菇生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)時(shí)期均可被侵染,其中搔菌到出芽階段最易受侵染[9]。目前,對(duì)該病菌的防治主要依靠噴施殺菌劑,但長(zhǎng)期使用會(huì)使異型葡枝霉的抗藥性增強(qiáng)且造成環(huán)境污染并增加生產(chǎn)成本,同時(shí)降低了金針菇鮮品品質(zhì)[10-11]。
在逆境條件下,植物產(chǎn)生的活性氧自由基會(huì)破壞自身細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì),進(jìn)而影響其正常生長(zhǎng)發(fā)育,同時(shí)在逆境條件下植物體內(nèi)存在的酶保護(hù)系統(tǒng)即抗氧化酶系統(tǒng)被激活可將其體內(nèi)多余的自由基消除[12]。病原菌與寄主相互競(jìng)爭(zhēng)與相互識(shí)別的過程中,寄主體內(nèi)被迫產(chǎn)生高于正常水平的活性氧,打亂了正常代謝功能。過氧化物酶、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶共同組成體內(nèi)有效的活性氧清除系統(tǒng),三者協(xié)同作用,可有效地清除植物體內(nèi)過氧化物和自由基[13]。多酚氧化酶可將酚類物質(zhì)氧化為對(duì)病原菌有毒的醌類物質(zhì),和植物的抗病性關(guān)聯(lián)密切,苯丙氨酸解氨酶是苯丙烷類代謝途徑中的限速酶和關(guān)鍵酶,為合成木質(zhì)素和植保素提供前體,因此被作為植物抗病性的一個(gè)生化指標(biāo)[14-15]。
目前,對(duì)綿腐病的研究主要集中在發(fā)生環(huán)境、生物學(xué)特性及防治等方面[16-17],而對(duì)金針菇抗性機(jī)制方面卻缺少系統(tǒng)性研究。選育對(duì)異型葡枝霉具強(qiáng)抗性的金針菇品種是防治病害發(fā)生的最有效方法之一,因此深入研究金針菇的抗性機(jī)制具有重要意義。結(jié)合植物的抗病機(jī)制,試驗(yàn)從病原物與寄主互作的角度出發(fā),研究寄主被侵染后不同金針菇品種與4種防御系酶活性變化的關(guān)系,以期為金針菇抗病品種選育中生理生化指標(biāo)的確定提供理論依據(jù)。
金針菇L3002、L3003、L3005菌株來源于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食(藥)用菌教育部工程研究菌種保藏中心,病原菌異型葡枝霉(Cladobotryum varium)JZ-01為長(zhǎng)春高榕公司金針菇菇房中具典型病狀的子實(shí)體分離所得,經(jīng)柯赫氏法則驗(yàn)證[18],現(xiàn)保存于菌種保藏試驗(yàn)室。
異型葡枝霉菌絲24℃暗光培養(yǎng)5 d,表面產(chǎn)生大量孢子后,用移液槍吸取無菌水置于培養(yǎng)皿內(nèi),多次吸打。后吸取1 mL孢子懸濁液于9 mL的無菌蒸餾水中,混勻,后取1 mL于9 mL無菌蒸餾水中,反復(fù)此操作,直至血球計(jì)數(shù)板檢測(cè)菌懸液的濃度為1×106個(gè)/mL[19]。
按金針菇工廠化的操作流程進(jìn)行栽培及出菇管理[20],在金針菇子實(shí)體長(zhǎng)至瓶口時(shí)將配制好的異型葡枝霉菌懸液以噴霧式接種于金針菇柄部,以無菌水處理為對(duì)照,于接種第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天取樣后立即放入液氮中,移入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
采用試劑盒法(南京建成生物工程研究所:過氧化物酶試劑盒,多酚氧化酶試劑盒,苯丙氨酸解氨酶試劑盒,超氧化物歧化酶試劑盒)對(duì)4種酶進(jìn)行測(cè)定,檢測(cè)方法按試劑盒說明書操作,每次測(cè)定重復(fù)3次取平均值。
記錄所得的數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計(jì)分析,將不同處理所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素顯著性分析,設(shè)定顯著性水平P為0.05,均值間不同小寫字母表示差異顯著。
不同金針菇子實(shí)體苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)活性變化見表1、圖1。
圖1 不同金針菇子實(shí)體的PAL活性變化Fig.1 Changes of PAL activity in different Flammulina filiformis fruiting bodies
表1 不同金針菇子實(shí)體的PAL活性變化Tab.1 Changes of PAL activity in different Flammulina filiformis fruiting bodies
由表1、圖1所示,接種病原菌后,不同金針菇菌株的子實(shí)體內(nèi)苯丙氨酸解氨酶PAL的活性均呈上升趨勢(shì),且不同菌株上升趨勢(shì)不同。達(dá)到峰值的時(shí)間也不同。L3005的PAL最大峰值高于L3002和L3003。L3005的PAL酶活性在第5天時(shí)達(dá)到最大峰值,隨后PAL活性逐漸下降,L3005的PAL活性波動(dòng)最大,最大酶活為 44.32 U·g-1min-1,是未接種時(shí)的3倍;L3003的PAL活性在第4天達(dá)到峰值為42.83 U·g-1min-1,是未接種的2.6倍;L3002的PAL活性波動(dòng)最小,在第3天達(dá)到峰值其活性是未接種時(shí)的2倍。3個(gè)不同金針菇菌株的子實(shí)體內(nèi)PAL活性與接種病原菌后的酶活性差異顯著(P<0.05)。
異型葡枝霉侵染不同金針菇子實(shí)體后多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)的活性變化見表2、圖2。
表2 不同金針菇子實(shí)體的PPO活性變化Tab.2 Changes of PPO activity in different Flammulina filiformis fruiting bodies
圖2 不同金針菇子實(shí)體的PPO活性變化Fig.2 Changes of PPO activity in different Flammulina filiformis fruiting bodies
由表2、圖2可知,不同金針菇菌株未經(jīng)過接菌處理其子實(shí)體內(nèi)的多酚氧化酶活性變化不大。接種后,不同金針菇菌株子實(shí)體內(nèi)PPO酶活性均呈上升趨勢(shì)。接種病原菌后,L3005的PPO活性波動(dòng)最大,第3天就達(dá)到最大峰值,為 40.92 U·g-1min-1,是其對(duì)照的 3.2倍;L3002和 L3003的波動(dòng)相對(duì)較小。L3003的PPO活性第3天達(dá)到峰值 29.7 U·g-1min-1是其對(duì)照的 2.2 倍;L3002的 PPO活性第 4天達(dá)到峰值 27.72 U·g-1min-1,是其對(duì)照的1.89倍。接種處理后,3個(gè)金針菇品種子實(shí)體內(nèi)PPO活性與其對(duì)照的酶活性差異顯著(P<0.05)。
異型葡枝霉侵染不同金針菇子實(shí)體后過氧化物酶(peroxidase,POD)的活性變化見表3、圖3。
表3 不同金針菇子實(shí)體的POD活性變化Tab.3 Changes of POD activity in different Flammulina filiformis fruiting bodie
圖3 不同金針菇子實(shí)體的POD活性變化Fig.3 Changes of POD activity in different Flammulina filiformis fruiting bodies
由表3、圖3可知,金針菇未受病原菌侵染時(shí),同一時(shí)期生長(zhǎng)的3個(gè)菌株子實(shí)體內(nèi)的過氧化物酶酶活變化不大,在同一水平上波動(dòng)。接種病原菌后,金針菇子實(shí)體內(nèi)的酶活發(fā)生變化,均呈上升趨勢(shì)。其中L3005和L3003的POD活性均在第2天達(dá)到峰值,L3002在第3天達(dá)到峰值。L3005和L3002的POD活性波動(dòng)較大。L3005的最大酶活達(dá)到384.21 U·g-1min-1,是其對(duì)照的3.75倍;L3002的最大酶活為 341.57 U·g-1·min-1,是其對(duì)照的 3.17 倍;L3003 的POD活性波動(dòng)相對(duì)較小,最大酶活為304.37 U·g-1min-1,是其對(duì)照的2.63倍。接種處理后,不同金針菇品種子實(shí)體內(nèi)的POD活性與未接種處理的酶活性差異顯著 (P<0.05)。
異型葡枝霉侵染不同金針菇子實(shí)體后超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的活性變化見表4、圖4。
圖4 不同金針菇子實(shí)體的SOD活性變化Fig.4 Changes of SOD activity in different Flammulina filiformis fruiting bodies
表4 不同金針菇子實(shí)體的SOD活性Tab.4 Changes of SOD activity in different Flammulina filiformis fruiting bodies
由表4、圖4可知,不同金針菇菌株體內(nèi)的SOD活性不同,波動(dòng)不大。接種病原菌后,金針菇子實(shí)體內(nèi)的SOD活性均呈上升趨勢(shì)。接種病原菌后,3個(gè)菌株均在3 d達(dá)到了最大峰值。且L3005的SOD活性偏高于L3002和L3003。L3005的SOD活性增幅最大,最大酶活為 729.63 U·g-1min-1,是其對(duì)照的 1.4倍;L3002 的最大酶活為 688.94 U·g-1min-1,是其對(duì)照的 1.3 倍;L3003 的最大酶活為674.91 U·g-1min-1,是其對(duì)照的1.26倍。接種處理后,3個(gè)金針菇菌株子實(shí)體內(nèi)SOD活性與未接種處理的酶活性差異性顯著 (P<0.05)。
當(dāng)生物被各類外源病原物侵染后,寄主細(xì)胞會(huì)調(diào)整自身體內(nèi)生理生化和組織結(jié)構(gòu)來適應(yīng)外源物刺激以達(dá)到生存的目的,其中以參與各種代謝的防御酶類的活性變化最為明顯[21]。苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)均屬于寄主防衛(wèi)系統(tǒng)的相關(guān)酶類,在某種程度上詮釋了寄主對(duì)病原菌的抗病程度,因此可以作為寄主抗病性的一個(gè)生理指標(biāo)[22]。
異型葡枝霉菌侵染金針菇后,激活金針菇體內(nèi)的主要防御酶系,使PAL、PPO、POD、SOD四種防御系酶的活性明顯增高。這與周春元[23]對(duì)雙孢蘑菇受濕泡病菌侵染后,雙孢蘑菇體內(nèi)的酶活性升高結(jié)果一致,也和大多前人對(duì)其他作物的研究結(jié)果一致[24-25]。接種異型葡枝霉菌后,相比對(duì)照未接種的3個(gè)金針菇菌株子實(shí)體內(nèi)的防御酶活性均有變化,出現(xiàn)最大峰值。其中,金針菇菌株L3005的PAL、PPO、POD、SOD活性均高于L3003和L3002。不同金針菇品種體內(nèi)防御酶活性變化不同,說明4種防御酶在不同金針菇品種受異型葡枝霉侵染的抗性機(jī)制中發(fā)揮了一定作用??赏ㄟ^對(duì)不同金針菇品種防御酶活性的測(cè)定,為篩選金針菇抗性品種提供一定的科學(xué)依據(jù)。
同一生長(zhǎng)時(shí)期金針菇子實(shí)體體內(nèi)防御性酶活性差異不大,且酶活性波動(dòng)趨勢(shì)相同。接種病原菌后,金針菇體內(nèi)的酶活均有不同變化,且被病原菌侵染后一定時(shí)間內(nèi)4種防御性酶的活力值均可達(dá)到峰值。金針菇接入病原菌后,其體內(nèi)的酶活性與正常金針菇體內(nèi)的酶活性差異顯著(P<0.05)。其中,金針菇L3005的酶活性變化幅度均大于L3002和L3003,其活力值也偏高于二者。即金針菇L3005品種對(duì)異型葡枝霉菌的抗性更強(qiáng)。表明金針菇棉腐病的抗性和防御酶系之間相連密切,產(chǎn)生峰值前后時(shí)間可以作為金針菇抗病性的一個(gè)重要生理生化指標(biāo)。