劉光榮，馬詩經(jīng)，韓 萍，車 飆，林 麗，杜志云

[1.無限極（中國）有限公司，廣東廣州5106233；2.佛山市康伲愛倫生物技術(shù)有限公司，廣東佛山528200；3.廣東工業(yè)大學(xué)生物醫(yī)藥學(xué)院，廣東廣州510006]

銀耳（Tremella fuciformis）為擔(dān)子菌門（basidiomycete）真菌銀耳的子實(shí)體，是一種食藥兼用真菌，享有“菌中之冠”的美譽(yù)，具有滋補(bǔ)生津、扶正固本的功效[1-2]。我國銀耳生產(chǎn)主要集中在四川通江、福建古田等地，隨著栽培技術(shù)的發(fā)展，銀耳產(chǎn)量大幅提高[3]。

研究證實(shí)，銀耳多糖為雜多糖[4]，其主鏈?zhǔn)怯搔?（1-3）-糖苷鍵組成的甘露聚糖，主鏈的2、4、6位上連接有葡萄糖、木糖、巖藻糖及糖醛酸等殘基組成的側(cè)鏈，其活性中心為α-（1-3）-甘露聚糖[5-6]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，銀耳多糖具有增強(qiáng)免疫力、抗氧化、抗炎、降血脂、抗輻射、減肥、促進(jìn)傷口愈合等多種藥理活性[7-10]。此外，角質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)蛋白組成了皮膚屏障，可以阻擋外界有害物質(zhì)（物理、化學(xué)等），若皮膚屏障破壞會引起皮膚水分流失、炎癥等問題，銀耳多糖已被證實(shí)具有極強(qiáng)的保濕性能，可作為天然保濕劑應(yīng)用于改善皮膚屏障損傷[11-13]。

目前，銀耳多糖的提取大多采用熱水提取法、酶輔助浸提法等。但銀耳子實(shí)體細(xì)胞壁具有蛋白質(zhì)和多糖結(jié)合的結(jié)構(gòu)，難以被破壞，不能充分釋放多糖。因此，通過對銀耳采用膠體磨處理后再進(jìn)行熱水浸提，以單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)方法分析優(yōu)化銀耳多糖提取工藝中提取溫度、料液比、提取時(shí)間的影響并進(jìn)行工藝優(yōu)化。同時(shí)與目前主要應(yīng)用的熱水浸提法進(jìn)行多糖提取效果的對比，進(jìn)一步分析銀耳多糖中分子量組成及其對十二烷基磺酸鈉（dodecyl sulfate,sodium salt，SDS）誘導(dǎo)的Hacat細(xì)胞損傷的修復(fù)作用，為其應(yīng)用到皮膚屏障保護(hù)提供科學(xué)與試驗(yàn)依據(jù)。

1 試驗(yàn)內(nèi)容

1.1 主要材料、試劑與儀器

銀耳子實(shí)體干品（產(chǎn)地四川通江），佛山市康伲愛倫生物技術(shù)有限公司；銀耳多糖，佛山市康伲愛倫生物技術(shù)有限公司。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%），阿拉?。ˋladdin）試劑公司；無水乙醇、濃硫酸、苯酚等（均為分析純試劑），廣州化學(xué)試劑廠；蒸餾水，自制。

1510酶標(biāo)儀，美國Thermo Fisher公司；UV-3600 Plus紫外可見光分光光度計(jì)，日本SHIMADZU公司；DK-S22電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Z326K離心機(jī)，德國Hermle公司；KQ3200DE數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；JMLB-100立式膠體磨，上海科勞機(jī)械設(shè)備有限公司；2414示差折光檢測器，沃特世科技（上海）有限公司；8角度激光散射儀，美國懷雅特技術(shù)公司；酶聯(lián)免疫檢測儀1510，美國Thermo Fisher公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

研究不同提取料液比、提取溫度、提取時(shí)間對銀耳多糖提取效果的影響。

1）料液比

固定時(shí)間為2 h、溫度為100℃，提取2次，探討不同料液比 （1∶25、1∶35、1∶45、1∶55、1∶65）對銀耳多糖提取率的影響。

2）溫度

固定液料比為1∶55、時(shí)間為2 h，提取2次，探討不同溫度（70℃、80℃、90℃、100℃）對銀耳多糖提取率的影響。

3）時(shí)間

固定溫度為100℃，料液比為1∶55，提取2次，探討不同時(shí)間（1 h、2 h、3 h、4 h）對銀耳多糖提取率的影響。

1.2.2 提取工藝

將銀耳子實(shí)體干品進(jìn)行研磨，過40目篩。準(zhǔn)確稱取銀耳粉100 g置于燒杯中，按設(shè)定的液料比加入蒸餾水，浸泡20 min后置于膠體磨中循環(huán)均質(zhì)處理5 min。按試驗(yàn)設(shè)計(jì)的提取溫度、料液比、提取時(shí)間進(jìn)行提取。提取液經(jīng)過濾后減壓濃縮至一定體積后，經(jīng)5 000 r·min-1離心10 min。取上層清液加入3倍體積的95%乙醇進(jìn)行沉定后減壓抽濾，沉淀物依次用無水乙醇、丙酮進(jìn)行洗滌后，冷凍干燥，得銀耳粗多糖凍干粉。

1.2.3 銀耳多糖提取率的測定

1）葡萄糖溶液配制

稱取適量葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，置于105℃烘箱中烘至恒重后，稱取恒重葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品100 mg，在100 mL容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精確移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲備液 0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL 分別置于 10 mL 容量瓶中，加蒸餾水定容，配制成濃度分別為0、0.02 mg·mL-1、0.04 mg·mL-1、0.06 mg·mL-1、 0.08 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取上述各葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL，置于10 mL具塞玻璃試管中，依次加入5%苯酚溶液0.5 mL，濃硫酸2.5 mL，充分渦旋，冷卻至室溫。另取蒸餾水1 mL，按照上述操作，作為空白對照。將上述溶液分別在490 nm波長處測定吸光度，得回歸方程為：

回歸方程R2＝0.999 7表明葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品在0～0.10 mg·mL-1內(nèi)濃度與吸光度呈良好線性關(guān)系。

3）銀耳多糖提取率測定

將銀耳多糖凍干粉溶于蒸餾水中，稀釋至濃度為0.1 mg·mL-1，吸取1 mL于具塞試管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作步驟操作，測定吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出粗多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，多糖提取率（D，%）的計(jì)算公式為：

式中：C為測得吸光度對應(yīng)的濃度（mg·mL-1）；V為提取液的體積（mL）；B為稀釋倍數(shù)；0.9為葡萄糖換算成多糖的正交系數(shù)；M為原料質(zhì)量（mg）。

1.2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝

為了進(jìn)一步確定最佳的提取條件，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以銀耳多糖的提取率作為指標(biāo)，選取料液比（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C）3個(gè)因素進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，具體因素、水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Tab.1 Factors and levels of orthogonal experimen

1.2.5 銀耳多糖分子量測定

參考孔令?yuàn)櫟萚14]的方法純化最佳工藝提取的銀耳多糖，并且采用高效液相色譜聯(lián)用多角度激光散射對銀耳多糖進(jìn)行分子量測定[15]。以葡聚糖（dextran）為標(biāo)準(zhǔn)品，色譜條件如下：7.8 mm×300 mm TSK-GELG5000PWXL色譜柱，流動相為超純水，進(jìn)樣量為 20 μL，流速為 0.6 mL·min-1，柱溫為30℃。采用2414示差折光檢測器和8角度激光散射儀進(jìn)行相關(guān)的檢測。

1.2.6 銀耳多糖對SDS誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞損傷后細(xì)胞存活率影響試驗(yàn)測定

參考崔樂[16]的測定方法，HaCaT細(xì)胞采用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，配制成濃度為1×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，鋪于96孔板內(nèi)，每孔100 μL。置于培養(yǎng)箱37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h之后，每孔加入濃度為50 μg·mL-1的SDS溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用移液槍吸除SDS溶液，用完全培養(yǎng)基將殘液清洗干凈。洗凈后以200 μL/孔分別加入完全培養(yǎng)基（空白對照組）和濃度 1 000.0 μg·mL-1、250.0 μg·mL-1、62.5 μg·mL-1的銀耳多糖溶液。繼續(xù)培養(yǎng)24 h之后，用完全培養(yǎng)基清洗干凈，洗凈后每孔加入MTT溶液100 μL，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h。然后用移液槍吸除MTT溶液后，每孔加入 DMSO溶液150 μL，將96孔板置于振蕩器上中速振蕩5 min。使用酶聯(lián)免疫檢測儀測量490 nm處的吸光度，細(xì)胞存活率（X，%）的計(jì)算公式為：

式中：S為試驗(yàn)組吸光度；CK為空白對照組吸光度；YCK為陰性對照組吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取料液比對銀耳多糖提取效果的影響

不同提取液料比對銀耳多糖提取率的影響情況見圖1。

圖1 液料比對銀耳多糖提取效果的影響Fig.1 Effects of liquid-solid ratio on the extraction rate of polysaccharides

由圖1可以看出，銀耳多糖提取率隨液料比的增大而提高，在1∶55時(shí)銀耳多糖提取率基本達(dá)到最大值。提取料液比為1∶25時(shí)，銀耳多糖溶出不充分，銀耳提取液較粘稠，過濾難度大。隨著料液比的增加，增大了銀耳細(xì)胞內(nèi)外的濃度差，使多糖容易溶出；隨著液料比的增加達(dá)到一定比例時(shí)，銀耳多糖幾乎全部被提取溶出。從節(jié)約能耗與后續(xù)工藝處理的成本考慮，選擇液料比為1∶55。初步分析選擇料液比1∶35、1∶45、1∶55作為正交試驗(yàn)的因素水平。

2.1.2 提取溫度對銀耳多糖提取效果的影響

不同提取溫度對銀耳多糖提取率的影響情況見圖2。

圖2 提取溫度對銀耳多糖提取效果的影響Fig.2 Effects of extraction temperature on the extraction rate of polysaccharides

由圖2可以看出，銀耳多糖的提取率隨溫度的變化呈增大趨勢，在提取溫度為100℃時(shí)，提取率達(dá)到最大值，明顯高于70℃、80℃時(shí)銀耳多糖提取率；而90℃與100℃所得的銀耳多糖提取率相差較小。說明提取溫度升高，在相同的提取時(shí)間內(nèi)，加快了銀耳細(xì)胞壁的破碎，促進(jìn)了銀耳中多糖的溶出。因此選擇銀耳多糖的提取溫度為90℃～100℃，初步分析選擇提取溫度80℃、90℃、100℃作為正交試驗(yàn)的因素水平。

2.1.3 提取時(shí)間對銀耳多糖提取效果的影響

不同提取時(shí)間對銀耳多糖提取率的影響情況見圖3。

圖3 提取時(shí)間對銀耳多糖提取效果的影響Fig.3 Effects of extraction time on the extraction rate of Tremella fuciformis polysaccharides

由圖3可知，銀耳多糖提取率隨提取時(shí)間的延長呈先升高而后降低的趨勢。在1 h～3 h之間，銀耳多糖提取率隨時(shí)間的延長而升高，可能是1 h提取時(shí)間過短，銀耳多糖不能被充分提??；而在相同溫度與料液比條件下，提取時(shí)間超過3 h可能會促使雜質(zhì)的溶出量增加而導(dǎo)致多糖的溶解度降低；多糖結(jié)構(gòu)降低不利于銀耳多糖活性，因而選擇銀耳多糖提取時(shí)間為2 h，初步分析選擇提取時(shí)間1 h、2 h、3 h作為正交試驗(yàn)的因素水平。

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2，正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果見表3。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Orthogonal array design with experimental results

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Tab.3 Analysis of variance for orthogonal array design

由表2、表3可知，影響銀耳多糖提取的因素中，以提取溫度的影響最大（P＜0.05），其次為料液比 （P＜0.05）與提取時(shí)間。提取的最佳條件是A3B3C2，即銀耳子實(shí)體經(jīng)過膠體磨處理后，以料液比1∶55，提取溫度100℃，提取時(shí)間2 h，提取2次的提取效果最佳。

采用最佳工藝條件與目前工業(yè)生產(chǎn)常用的銀耳多糖提取工藝進(jìn)行對比，銀耳多糖提取的效果，具體見表4。

表4 不同工藝對銀耳多糖提取率的影響Tab.4 Effect on the extraction rate of Tremella fuciformis polysaccharide by different technology

由表4可以看出，將銀耳子實(shí)體用膠體磨處理后，有助于銀耳子實(shí)體細(xì)胞壁的破碎，促進(jìn)銀耳多糖的溶出，提取率明顯高于工業(yè)生產(chǎn)所用常規(guī)工藝?？梢泽w現(xiàn)本次試驗(yàn)工藝優(yōu)勢，同時(shí)工藝的設(shè)備簡單，適合進(jìn)行放大生產(chǎn)。

2.3 銀耳多糖分子量試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)純化后的銀耳多糖純化率為99.2%，以不同分子量葡聚糖（10 kDa～2 000 kDa）為標(biāo)準(zhǔn)品，出峰時(shí)間曲線的回歸方程為：

出峰曲線見圖4。

圖4 不同分子量葡聚糖與出峰時(shí)間曲線Fig.4 The curve of different molecular weight of dextran and peak time

由圖4可以看出，出峰時(shí)間段為8 min～16 min，提示線性關(guān)系良好（R2＝0.992 7）。經(jīng)過測定，銀耳多糖的保留時(shí)間為 9.73 min～20.79 min。銀耳多糖分子量的比例見表5。

表5 銀耳多糖分子量分布Tab.5 Molecular weight distribution of Tremella fuciformis polysaccharide

由表5可知，提取的銀耳多糖分子量范圍為180 Da～1 231 000 Da，其中低于100 kDa分子量的銀耳多糖占82.75%，100 kDa分子量以上銀耳多糖占17.25%，說明本次試驗(yàn)最佳工藝條件下所得主要為小分子量的銀耳多糖。

2.4 銀耳多糖對SDS誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞損傷后細(xì)胞存活率試驗(yàn)結(jié)果

選取一種市售銀耳多糖對比自制銀耳多糖功效，銀耳多糖修復(fù)屏障損傷HaCaT細(xì)胞的細(xì)胞存活率試驗(yàn)結(jié)果見圖5。

圖5 銀耳多糖修復(fù)屏障損傷HacaT細(xì)胞存活率試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 The results of the survival rate of HaCaT cells by Tremella fuciformis polysaccharide

由圖5可以看出，自制銀耳多糖在濃度62.5 μg·mL-1、250.0 μg·mL-1、1 000.0 μg·mL-1條件下，Ha-CaT細(xì)胞的存活率均大于80%，并且在濃度相同時(shí)，自制銀耳多糖效果明顯優(yōu)于市售銀耳多糖。與模型組相比，在設(shè)定濃度下自制銀耳多糖均對由SDS誘導(dǎo)損傷的HaCaT細(xì)胞具有保護(hù)修復(fù)作用，在250 μg·mL-1濃度下其效果接近空白組，也為自制銀耳多糖損傷HaCaT細(xì)胞的最佳作用濃度。結(jié)合表5數(shù)據(jù)，自制銀耳多糖多為小分子，而市售銀耳多糖可能是大分子量銀耳多糖為主，因此自制的銀耳多糖更容易透過細(xì)胞，發(fā)揮修復(fù)屏障損傷HaCaT細(xì)胞的作用。

3 結(jié)論

銀耳子實(shí)體的細(xì)胞壁具雙層蛋白質(zhì)與多糖結(jié)合的致密結(jié)構(gòu)，經(jīng)膠體磨處理后，使得提取溶劑更容易穿透銀耳細(xì)胞，促進(jìn)銀耳多糖的溶解與釋放，從而提高了提取效率。試驗(yàn)結(jié)果表明，銀耳多糖提取工藝的最優(yōu)條件是料液比1∶55，提取溫度為100℃，提取時(shí)間2 h，提取次數(shù)為2次。在最優(yōu)條件下，銀耳多糖提取率可達(dá)（23.04±0.18）%，比工業(yè)生產(chǎn)常規(guī)工藝的銀耳多糖提取率明顯提高。最佳工藝條件下所得主要為100 kDa以下的小分子量銀耳多糖，進(jìn)一步試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)本次試驗(yàn)所得銀耳多糖具有明顯的修復(fù)SDS誘導(dǎo)損傷HaCaT細(xì)胞作用。