馬銀鵬，孔祥輝，韓增華，馬慶芳，戴肖東，劉佳寧，張介馳，張丕奇

（黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，黑龍江 哈爾濱 150010）

黑木耳（Auricularia heimuer）[1]富含蛋白質(zhì)、粗纖維、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，含有的多糖、黑色素、腺苷等活性物質(zhì)具有抗氧化、降血脂、降血糖等功效，是一種珍貴的食（藥）用菌[2]。目前，黑木耳栽培以露地栽培模式為主[3]，環(huán)境的可控性較差，整個生長發(fā)育期間時常受到各種生物和非生物的脅迫[4]。在非生物脅迫中，溫度是對食用菌生長發(fā)育影響最活躍、最重要的因素[5]。

高溫是導(dǎo)致食用菌產(chǎn)量降低和品質(zhì)下降的重要非生物脅迫因子之一，生物體對高溫脅迫的耐受性是其賴以生存和正常發(fā)育的重要特性[6]。真菌菌絲的培養(yǎng)特征與環(huán)境條件密切相關(guān)，層孔菌屬（Fomes sp.）菌株EUM1在40℃高溫脅迫時，菌絲體分支率、菌絲長度和菌絲直徑分別降低15%、32%和13%[7]。劉秀明等[8]研究了不同白靈側(cè)耳（Pleurotus eryngii var.tuoliensis）菌株對高溫脅迫的反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4個白靈側(cè)耳菌株高溫脅迫后，恢復(fù)培養(yǎng)時菌落的生長速率、生長勢和菌絲形態(tài)特征存在差異。不同種類食用菌不僅菌落形態(tài)不同，而且菌絲的微觀形態(tài)也不完全相同[9]，在受到高溫脅迫后，菌絲的微觀形態(tài)對高溫脅迫的應(yīng)激反應(yīng)也不相同。開展高溫脅迫的生理研究時，需要穩(wěn)定的試驗條件和參數(shù)，以優(yōu)化高溫脅迫響應(yīng)機制研究的試驗條件。張美敬等[10]研究了糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus）和白黃側(cè)耳（P.cornucopiae）高溫脅迫的條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2種側(cè)耳的高溫脅迫溫度為40℃，脅迫時間為48 h。目前對黑木耳高溫脅迫條件的研究報道較少，僅李紅等[11]比較了遼寧省主栽的9個黑木耳菌株的耐高溫能力，發(fā)現(xiàn)“黑29”和”純黑山”經(jīng)42℃高溫脅迫8 h后可恢復(fù)正常生長。

因此，通過對不同黑木耳菌株最適生長溫度，高溫脅迫溫度和脅迫時間的測定，研究高溫脅迫后黑木耳菌絲恢復(fù)生長的情況，以期獲得黑木耳高溫脅迫生理研究的試驗條件和參數(shù)，以確定黑木耳高溫脅迫的最適條件。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株

27株黑木耳菌株材料信息見表1，均保藏于黑龍江省科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心。

表1 供試材料Tab.1 Strains used in this study

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基，購于青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 最適生長溫度

將黑木耳菌種繼代培養(yǎng)后3次活化，使用菌齡7 d的菌種為材料，沿菌落邊緣用打孔器打取直徑1 cm的菌塊，接種到PDA培養(yǎng)基中央（培養(yǎng)皿直徑90 mm），培養(yǎng)基定量25 mL，菌絲面朝上。分設(shè)25℃、28℃、30℃、33℃、35℃、38℃共6個溫度梯度，每個溫度梯度設(shè)5個重復(fù)。分別于各溫度條件下培養(yǎng)，菌絲生長量以菌落直徑計量，以長速最快的菌株長滿培養(yǎng)皿時終止培養(yǎng)，用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.2 高溫脅迫處理條件

參考植物高溫脅迫處理溫度，即高溫脅迫處理溫度為最適溫度提高10℃[10]，分設(shè)為最適生長溫度提高10℃、提高12℃和提高14℃共3種高溫脅迫處理方式。以最適生長溫度培養(yǎng)7 d的各黑木耳菌株為試驗材料，高溫脅迫處理后于最適生長溫度下恢復(fù)生長，以高溫脅迫后菌絲恢復(fù)生長情況為指標(biāo)，研究黑木耳菌株高溫脅迫處理的最適條件。

1.2.3 高溫脅迫后菌絲恢復(fù)生長情況

黑木耳菌株于最適生長溫度條件下培養(yǎng)7 d，最適高溫脅迫條件處理，最適生長溫度恢復(fù)培養(yǎng)，觀測計算菌絲恢復(fù)的生長速率。挑取恢復(fù)的黑木耳菌絲于顯微鏡下觀察恢復(fù)后菌絲尖端的顯微形態(tài)，測量菌絲尖端直徑。黑木耳菌株恢復(fù)生長10 d后，觀察菌絲色素產(chǎn)生情況。每個處理3個重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 16軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析方法進(jìn)行顯著性分析，不同小寫字母表示差異達(dá)到顯著水平 （P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌絲最適生長溫度

不同溫度條件下黑木耳菌株菌絲平均生長速率見圖1。

圖1 不同溫度條件下黑木耳菌株菌絲平均生長速率Fig.1 Mycelial growth rate of Auricularia heimuer strains under different temperatures

由圖1可知，隨著培養(yǎng)溫度提高，黑木耳菌株菌絲平均生長速率呈先升高后降低趨勢，其中以30℃下黑木耳菌株菌絲平均生長速率最大，為（0.42±0.08）cm·d-1，25℃下黑木耳菌株菌絲平均生長速率最小，為 （0.36 ± 0.11）cm·d-1。

不同黑木耳菌株最適生長溫度不完全相同，其中14株（51.9%）黑木耳菌株在30℃下菌絲生長速率最大，8株（29.6%）黑木耳菌株在33℃下菌絲生長速率最大。38℃下黑木耳菌株菌絲均未萌發(fā)生長，可能是由于38℃下培養(yǎng)基失水太快，菌絲萌發(fā)困難。

不同溫度條件下各黑木耳菌株菌絲均潔白濃密，長勢較好，其中28℃和30℃下菌絲長勢最佳。隨著培養(yǎng)溫度的提高，黑木耳菌株氣生菌絲呈增加趨勢。

綜合以上試驗結(jié)果，選取黑木耳菌株的最適生長溫度為30℃。

2.2 高溫脅迫處理條件

高溫脅迫處理結(jié)果發(fā)現(xiàn)，40℃和42℃分別處理2 h、4 h和6 h，30℃時所有黑木耳菌株均可恢復(fù)生長。44℃處理2 h，30℃時所有黑木耳菌株均可恢復(fù)生長，但不同黑木耳菌株菌絲恢復(fù)生長速率不同。44℃處理4 h，30℃時8株（29.6%）黑木耳菌株恢復(fù)生長。44℃處理6 h，30℃時2株（7.4%）黑木耳菌株恢復(fù)生長，2株（7.4%）黑木耳菌株恢復(fù)生長較慢。隨著脅迫溫度的升高，培養(yǎng)基內(nèi)水分損失較嚴(yán)重，影響黑木耳菌絲恢復(fù)生長。綜合考慮，黑木耳菌株菌絲最適高溫脅迫條件為44℃處理2 h。

2.3 高溫脅迫后菌絲恢復(fù)生長情況

黑木耳菌株最適高溫脅迫條件下菌絲恢復(fù)生長情況見表2。

表2 黑木耳菌株高溫脅迫后菌絲恢復(fù)生長情況Tab.2 Recovery of mycelical growth of Auricularia heimuer strains under heat stress

由表2可知，44℃高溫脅迫處理2 h，置于30℃培養(yǎng)4 d，所有黑木耳菌株菌絲均恢復(fù)生長，但是菌絲恢復(fù)生長速率不同，不同黑木耳菌株菌絲恢復(fù)生長速率差異顯著（P＜0.05）。農(nóng)06（編號15）菌絲恢復(fù)生長速率，最大為 （0.40 ± 0.17）cm·d-1，黑蓮（編號 22）菌絲恢復(fù)生長速率，最慢為 （0.09±0.12）cm·d-1。

不同黑木耳菌株高溫脅迫處理后，菌絲恢復(fù)生長長勢、菌絲尖端變化、菌絲尖端直徑、色素產(chǎn)生情況不同。11株（40.7%）黑木耳菌株菌絲恢復(fù)后長勢較好，菌絲潔白、濃密，而其他黑木耳菌株菌絲恢復(fù)后長勢一般，菌絲較潔白、稀疏。15株（55.6%）黑木耳菌株高溫脅迫后在脅迫處形成凸起，凸起處氣生菌絲較多，恢復(fù)生長后新生長的菌絲與未高溫脅迫處理菌絲基本一致。各黑木耳菌株菌絲尖端直徑為 0.77 μm～1.15 μm，其中特產(chǎn) 2 號菌絲尖端直徑最大為 （1.15± 0.01）μm；興安 4 號菌絲尖端直徑最小為 （0.77±0.03）μm。11 株 （40.7%）黑木耳菌株高溫脅迫后產(chǎn)生色素，其他黑木耳菌株高溫脅迫后產(chǎn)生少量色素或不產(chǎn)生色素。

3 討論與結(jié)論

生物體對環(huán)境脅迫的應(yīng)答一直是生物學(xué)的基本問題。環(huán)境條件（溫度、濕度、pH、滲透壓、氧分壓等）的改變均會對生物體造成壓力或脅迫。溫度是影響生物體生理過程的重要生態(tài)因子之一，而食用菌在生長發(fā)育過程中，遇到高溫脅迫時，會造成菌絲生長停滯、污染甚至死亡。決超[12]研究發(fā)現(xiàn)高溫對糙皮側(cè)耳生長發(fā)育4個典型階段的生理生化特征造成影響，如對菌絲丙二醛（MDA）含量、可溶性物質(zhì)變化、胞外酶、抗氧化酶活性和酯酶同工酶有影響。仇志恒[13]研究發(fā)現(xiàn)高溫脅迫后的糙皮側(cè)耳菌絲抵御棘孢木霉（Trichoderma asperellum）侵染的能力下降。因此，高溫影響食用菌的生理過程，已成為限制食用菌生產(chǎn)的主要環(huán)境因子。不同種類食用菌對高溫脅迫響應(yīng)不同，最適高溫脅迫處理條件存在差異。張美敬等[10]優(yōu)化了糙皮側(cè)耳和白黃側(cè)耳高溫脅迫條件，脅迫研究條件為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)菌絲3 d，最適高溫脅迫溫度為40℃（最適溫度加12℃），高溫脅迫處理48 h。

本研究發(fā)現(xiàn)黑木耳菌絲最適脅迫溫度為44℃處理2 h；黑木耳高溫脅迫溫度為最適合溫度加14℃，可能是由于黑木耳菌絲對高溫的耐受性較強，與李紅等[11]的研究結(jié)果相似，44℃高溫脅迫處理6 h后仍有4株黑木耳菌株能恢復(fù)生長。說明黑木耳菌絲較能耐高溫，但對高溫脅迫時間耐受性較差，可能是由于長時間的高溫脅迫導(dǎo)致培養(yǎng)基失水過多，黑木耳菌絲無法繼續(xù)生長。

高溫脅迫下，氧化應(yīng)激增強會引起活性氧（reactive oxygen species，ROS）氧化生物膜，而形成脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物等[14]。硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物（thiobarbituric acid reactive substances， TBARS）包 含 了大部分氧化傷害產(chǎn)生的醛酮類物質(zhì)，因此作為衡量脂質(zhì)過氧化的重要生理指標(biāo)[15]。另外，高溫脅迫下菌絲保護(hù)酶活性的變化也可作為一種評價指標(biāo)。郭敬等[16]研究發(fā)現(xiàn)高溫脅迫對白玉菇（Hypsizygus marmoreus）、杏鮑菇（Pleurotus eryngii）、真姬菇（Hypsizygus marmoreus）菌絲胞內(nèi)酶和菌絲保護(hù)酶均有不同程度影響。此次研究僅通過高溫脅迫后菌絲恢復(fù)生長情況初步確定了黑木耳最適高溫脅迫條件，結(jié)果有待通過菌絲保護(hù)酶活性等方面的研究進(jìn)一步優(yōu)化。