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        高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豆芽中4-氯苯氧乙酸、6-芐基腺嘌呤殘留量的不確定度評(píng)定

        2021-03-11 08:20:20唐韻熙
        現(xiàn)代食品 2021年1期
        關(guān)鍵詞:腺嘌呤芐基豆芽

        ◎ 唐韻熙

        (重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院,重慶 401121)

        豆芽因其產(chǎn)量高、價(jià)格便宜、有利于消化且加工方便,成為人們餐桌上的日常食品,受到普遍歡迎。但在豆芽生產(chǎn)過程中,各地多次出現(xiàn)了黑作坊生產(chǎn)的“毒豆芽”,嚴(yán)重危害著廣大消費(fèi)者的健康。其大多是不法商販為了提高豆芽的產(chǎn)率,縮短豆芽生長周期,在豆芽生產(chǎn)過程中添加4-氯苯氧乙酸(4-CPA)、6-芐基腺嘌呤(6-BA)等植物生長調(diào)節(jié)劑以及抗生素類藥物,促進(jìn)豆芽下胚軸粗大,減少根部萌發(fā),加速細(xì)胞分裂,且能起到抗菌、殺菌作用,使豆芽在生長過程中免受微生物的侵蝕。經(jīng)常食用這些“毒豆芽”,會(huì)使人體內(nèi)殘留高劑量的藥物,可能影響中樞神經(jīng)[1-9]?!秶沂称匪幤繁O(jiān)督管理總局、農(nóng)業(yè)部、國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)關(guān)于豆芽生產(chǎn)過程中禁止使用6-芐基腺嘌呤等物質(zhì)的公告》(2015年第11號(hào))[10]中明確規(guī)定,生產(chǎn)者不得在豆芽生產(chǎn)過程中使用4-氯苯氧乙酸鈉、6-芐基腺嘌呤;豆芽經(jīng)營者不得經(jīng)營含4-氯苯氧乙酸鈉、6-芐基腺嘌呤的豆芽。

        植物生長調(diào)節(jié)劑的化學(xué)性質(zhì)和生物特性因其種類繁多而各有異同,有較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng),殘留量低,為提高檢測(cè)質(zhì)量與準(zhǔn)確度,需對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行不確定度評(píng)定。目前,植物生長調(diào)節(jié)劑僅有6-芐基腺嘌呤、吲哚乙酸、吲哚丁酸和多效唑的非標(biāo)準(zhǔn)方法的不確定度報(bào)道[11-12],因此,本文建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)豆芽中4-CPA、6-BA 含量的測(cè)定方法,并且依據(jù)《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》(JJF 1059.1—2012)[13]、《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》[14]的相關(guān)規(guī)定,對(duì)該方法的不確定度進(jìn)行評(píng)定,找出影響測(cè)定結(jié)果的主要因素,并進(jìn)行不確定度分析計(jì)算,進(jìn)而對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)判,提高檢測(cè)質(zhì)量。

        1 材料與方法

        1.1 儀器與試劑

        AB5500 串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國AB SCIEX 公司)、1290 高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)、3-30KS 型冷凍離心機(jī)(德國Sigma 公司)、ML-886 渦旋儀(海門市其林貝爾儀器)、Turbovap LV 全自動(dòng)濃縮儀(英國Biotage 公司)、Milli-Q reference 型純水機(jī)(美國MILLIPORE 超純水系統(tǒng))、MSA225S-100-DU 電子分析天平(十萬分之一,德國Sartorius 公司)、ME203/02 電子分析天平(千分之一,瑞士METTLER TOLEDO 公司)。

        4-氯苯氧乙酸(4-CPA)標(biāo)準(zhǔn)品(德國Dr.Ehrenstorfer公司,純度:98.11%)、6-芐基腺嘌呤(6-BA)標(biāo)準(zhǔn)品(德國Dr.Ehrenstorfer 公司,純度:98.51%)、甲醇、乙腈、甲酸、無水硫酸鎂、無水乙酸鈉、Bondesil-C18。

        1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

        分別準(zhǔn)確稱取10.73 mg 4-CPA、10.24 mg 6-BA 于10 mL 容量瓶中,甲醇溶液定容,配制成濃度分別為1.053 mg·mL-1、1.009 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

        混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1 配制[c(4-CPA)=10.53 μg·mL-1,c(6-BA)=10.09 μg·mL-1]:分別移取100 μL 4-CPA和100 μL 6-BA 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至10 mL 容量瓶,用甲醇定容至刻度。

        混合標(biāo)準(zhǔn)溶液2 配制[c(4-CPA)=1.053 μg·mL-1,c(6-BA)=1.009 μg·mL-1]:準(zhǔn)確移取1 mL 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1 至10 mL 容量瓶,用甲醇定容至刻度。

        標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液配制:分別準(zhǔn)確移取10 μL、20 μL、40 μL 混合標(biāo)準(zhǔn) 溶 液2,10 μL、15 μL、20 μL 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1 于1 mL 容量瓶中,用陰性基質(zhì)定容至刻度。

        1.3 方法

        1.3.1 試樣制備

        稱取5 g均質(zhì)的豆芽樣品于50 mL聚丙烯離心管中,加入10 mL 的1%甲酸乙腈溶液,振蕩渦旋5 min,加入2 g 無水硫酸鎂、0.5 g 無水乙酸鈉,迅速振搖,于9 000 r·min-1離心10 min,準(zhǔn)確移取4 mL 上清液至干凈離心管中,45 ℃氮吹干,加入1 mL 甲醇溶解,超聲5 min,轉(zhuǎn)移上述溶解液于1.5 mL 凈化小管中(內(nèi)含75 mg 無水硫酸鎂,25 mg C18),渦旋2 min,10 000 r·min-1離心5 min,取上清液過0.22 μm 濾膜,待LC/MS/MS 分析。

        1.3.2 液相色譜

        色譜柱:Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);柱溫:40 ℃;流動(dòng)相A:0.1 %甲酸水溶液;流動(dòng)相B:乙腈。梯度洗脫程序:0 ~0.5 min,10% B,0.5 ~2.5 min,10% B →90% B,2.5 ~4.5 min,90% B,4.5 ~4.6 min,90% B →10% B,4.6 ~6.5 min,90% B,流速為0.3 mL·min-1,進(jìn)樣量1 μL。

        1.3.3 質(zhì)譜條件

        電噴霧(ESI)離子源,負(fù)離子模式;掃描模式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);離子源溫度:550 ℃;離子源電壓:4 500 V;氣簾氣壓力:275.79 kPa;GAS1:379.21 kPa,GAS2:379.21 kPa;目標(biāo)化合物的監(jiān)測(cè)離子對(duì),去簇電壓(DP)和碰撞能(V)參數(shù)見表1。

        表1 4-CPA 及6-BA 的母離子、子離子及其他質(zhì)譜參數(shù)表

        1.3.4 數(shù)學(xué)模型

        樣品中待測(cè)組分的含量的計(jì)算公式為:

        式中,X-樣品中待測(cè)組分的含量,單位為μg·kg-1;C-從標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的樣品溶液中待測(cè)組分的濃度,單位為ng·mL-1;V-樣品溶液最終定容體積,單位為mL;m-稱樣量;fr-待測(cè)組分的回收率(%);2.5-稀釋倍數(shù)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 樣品的不確定度來源

        根據(jù)試驗(yàn)測(cè)試過程,分析影響豆芽試樣中4-CPA及6-BA 殘留量測(cè)定結(jié)果的各種不確定的因素,評(píng)價(jià)不確定度來源主要有:樣品前處理制備、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制(包括儲(chǔ)備液與混合中間溶液的配制過程)、標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制、根據(jù)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品濃度、回收率以及測(cè)試儀器。

        2.2 由樣品前處理引入的相對(duì)不確定度urel(樣品)

        樣品前處理引入的不確定度主要有樣品稱量urel(m樣)、加入提取試劑0.1%甲酸乙腈體積urel(V10mL)、移取4 mL提取試劑urel(V4mL),最終定容體積urel(V1mL),各分量不相關(guān),具體見表2。合成樣品前處理制備的相對(duì)不確定度為:

        表2 樣品前處理引入的不確定度表

        2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的相對(duì)不確定度urel(s)

        標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的相對(duì)不確定度主要來源于標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制urel(s1)、標(biāo)準(zhǔn)中間溶液配制urel(s2)和urel(s3)、標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制urel(s4)。

        2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制引入的相對(duì)不確定度urel(s1)

        其主要來源有:標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的不確定度urel(p)、標(biāo)準(zhǔn)品稱量引入的不確定度urel(ms)、10 mL容量瓶校準(zhǔn)和溫度效應(yīng)引入的不確定度urel(V10mL),具體見表3。

        表3 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制引入的相對(duì)不確定度表

        續(xù)表3

        2.3.2 混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液配制引入的相對(duì)不確定度urel(s2)和urel(s3)

        混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液1、2 配制過程中引入的不確定度主要是:200 μL 移液槍、1 mL 移液槍、10 mL容量瓶以及容量瓶溫度效應(yīng)。根據(jù)移液槍校準(zhǔn)證書,200 μL 和1 mL 移液槍最大允許誤差分別是±0.3%和±0.4%,按矩形分布,k=,則兩者產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

        由表3 可知,10 mL 容量瓶引入的相對(duì)不確定度urel(V10mL)=0.003 38,將上述分量合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

        2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制引入的相對(duì)不確定度urel(s4)

        標(biāo)準(zhǔn)工作溶液是由豆芽陰性基質(zhì)逐級(jí)稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液配制而成的。配制過程中引入的不確定度分量及數(shù)值見表4[15],則合成各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度點(diǎn)引入的相對(duì)不確定度為:

        表4 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過程中引入的不確定度表

        2.4 根據(jù)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品濃度引入的不確定度u(y)

        將標(biāo)準(zhǔn)曲線的6 個(gè)濃度點(diǎn)每個(gè)進(jìn)樣3 次,以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(C,ng·mL-1),目標(biāo)物分子離子峰的峰面積為縱坐標(biāo)(A)進(jìn)行線性回歸,回歸方程、相關(guān)系數(shù)r見表5。

        標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度按式(3)計(jì)算:

        其中Sr按公式(4)計(jì)算:

        式中Sr為標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)差,Sr(4-CPA)=21.414 4;Sr(6-BA)=15.778 1;m為 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度點(diǎn)個(gè)數(shù),m=6;n為標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定次數(shù),n=3;p為待測(cè)物質(zhì)測(cè)定次數(shù),p=3,為標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均濃度;a為斜率,b為截距。

        表5 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及線性表

        將被測(cè)樣品平行測(cè)定3 次,分別從標(biāo)準(zhǔn)曲線算出的4-CPA 和6-BA 化合質(zhì)量濃度Cx(ng·mL-1)見表6。

        表6 被測(cè)樣品的測(cè)定數(shù)據(jù)表

        被測(cè)樣品由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:urel(y4-CPA)=0.041 56,urel(y6-BA)=0.040 13。

        2.5 回收率測(cè)試過程引入的不確定度urel(fr)

        在6份空白豆芽試樣中分別加入絕對(duì)含量為52.65 ng的4-氯苯氧乙酸(4-CPA)和50.45 ng 6-芐基腺嘌呤(6-BA)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照1.3.1、1.3.2 和1.3.2 試樣制備和儀器條件進(jìn)行操作,結(jié)果見表7。按照式以下公式計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差、回收率不確定度和回收率相對(duì)不確定度。

        計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差:

        回收率不確定度:

        回收率相對(duì)不確定度:

        表7 回收率引入的不確定度表

        用t檢驗(yàn)法,,來檢驗(yàn)回收率是否與100%存在顯著差異性,結(jié)果見表7。由于t值>臨界值(2.57),說明平均回收率與100%回收率之間有顯著性差異,回收率矯正因子必須在計(jì)算公式中采用,以修正結(jié)果。

        2.6 檢測(cè)儀器引入的相對(duì)不確定度urel(fm)

        根據(jù)《液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 儀器校準(zhǔn)證書》知,urel(fm)=4.0%。

        3 標(biāo)準(zhǔn)不確定度的合成與擴(kuò)展

        3.1 各分量不確定度匯總

        對(duì)于豆芽中4-CPA 和6-BA 測(cè)定結(jié)果有影響的各種不確定分量來源匯總見表8。

        表8 各分量不確定度匯總表

        3.2 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

        由于上述各因素的不確定度互不相關(guān),合成豆芽中4-CPA 和6-BA 含量的相對(duì)不確定度為:

        3.3 相對(duì)擴(kuò)展不確定度

        在95%置信水平下,k=2,4-CPA 的相對(duì)擴(kuò)展不確定度為u(4-CPA)=9.06×0.095 14=0.86 μg·kg-1;6-BA的相對(duì)擴(kuò)展不確定度為u(6-BA)=9.41×0.093 98=0.88 μg·kg-1。

        3.4 測(cè)定結(jié)果

        按照該方法測(cè)定豆芽中4-CPA 含量的結(jié)果為:X(4-CPA)=(9.06±0.86)μg·kg-1,k=2;X(6-BA)=(9.41±0.88)μg·kg-1,k=2。

        4 結(jié)論

        通過不確定度評(píng)定分析,采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)中豆芽中4-CPA 和6-BA 含量的過程中,樣品前處理制備引起的不確定度最大,其次是由儀器以及標(biāo)準(zhǔn)溶液配制和通過標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合求得樣品濃度值過程帶入。因此,在實(shí)際工作中應(yīng)對(duì)樣品前處理進(jìn)行規(guī)范操作,同時(shí)選取精密性高的儀器進(jìn)行檢測(cè),高精密度天平精密稱量,高精密度的移液槍和容量瓶進(jìn)行溶液配制,從而提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度和可靠性。

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