◎ 金倩儀

（中山市食品藥品檢驗所，廣東 中山 528437）

通過室間比對和盲樣考核是一種提升食品微生物實驗室檢測能力的常見方式，因此，實驗室會每年定期參加不同的能力驗證以促進實驗室檢測能力穩(wěn)步提升。2020 年，中山市食品藥品檢驗所參與了由廣東省市場監(jiān)督管理局組織的“2020 年食品安全抽檢監(jiān)測工作承檢機構(gòu)微生物檢驗實驗室間比對”，現(xiàn)將有關(guān)實驗報道如下，以其為今后食品微生物檢測工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 檢測樣品

由廣東省微生物分析檢測中心提供的4 個不同凍干樣品（菌落總數(shù)1 個、大腸菌群1 個以及沙門氏菌2 個），采用西林瓶真空密閉包裝，分別編號為A1、E1、S34 和S78。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑

磷酸鹽緩沖液、平板計數(shù)瓊脂、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）、煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）、緩沖蛋白胨水、TTB 增菌液、SC 增菌液、BS 瓊脂、三糖鐵、革蘭氏染色液、賴氨酸脫羧酶肉湯及氨基酸脫羧酶對照均購自北京陸橋技術(shù)有限公司；沙門氏菌屬診斷血清購于泰國S&A 公司；沙門顯色培養(yǎng)基購自法國科瑪嘉；API 20E 革蘭氏陰性細菌鑒定卡和VIDAS沙門氏菌屬篩檢試劑條均購于梅里埃診斷產(chǎn)品（上海）有限公司。

1.2.2 儀器

電子天平、生化培養(yǎng)箱、電子顯微鏡、生物安全柜、均質(zhì)器、VITEK 2 Compact 全自動微生物分析系統(tǒng)、mini-VIDAS 全自動免疫熒光分析儀。

1.3 檢驗環(huán)境

整個實驗在二級生物安全實驗室進行，遵循無菌操作原則進行。

1.4 檢驗方法

菌落總數(shù)、大腸菌群、沙門氏菌的檢驗方法如表1。

表1 實驗室間比對微生物檢驗項目和方法列表

1.5 樣品制備

按作業(yè)指導(dǎo)書上樣品處理的操作方法，在生物安全柜內(nèi)無菌操作開啟樣品后，將粉末按步驟溶解于100 mL 磷酸鹽緩沖液作為樣品原液，按相應(yīng)方法進行檢驗。

1.6 菌落總數(shù)的檢驗

取25 mL 樣品混懸液于225 mL 的磷酸鹽緩沖液中，用均質(zhì)器拍打混勻，作為第一稀釋度。再取1 mL（1 ∶10）的樣品勻液于9 mL 磷酸鹽緩沖液中，振蕩混勻作為第二稀釋度。按照同樣的步驟做到第八稀釋度。吸取1 mL 稀釋液于無菌平皿內(nèi)倒入平板計數(shù)瓊脂，（36±1）℃倒置培養(yǎng)（48±2）h[1]。

1.7 大腸菌群計數(shù)的檢驗

樣品稀釋同1.6。樣品稀釋至第七稀釋度，吸取1 mL稀釋液于無菌平皿內(nèi)倒入VRBA 瓊脂，（36±1）℃倒置培養(yǎng)18 ～24 h。從VRBA 平板上挑取10 個不同類型的典型可疑菌落，少于10 個菌落的挑取全部典型可疑菌落。分別移種于BGLB 肉湯管內(nèi)，（36±1）℃培養(yǎng)24 ～48 h，觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB 肉湯管產(chǎn)氣，即可報告為大腸菌群陽性[2]。

1.8 沙門氏菌的檢驗

1.8.1 前增菌

取25 mL 樣品混懸液于225 mL 的緩沖蛋白胨水中，振蕩混勻，于（36±1）℃培養(yǎng)8 ～18 h[3]。

1.8.2 增菌

各取1 mL 輕搖培養(yǎng)過的混勻液于10 mL 的TTB增菌液、SC 增菌液中培養(yǎng)。TTB 增菌液需在（42±1）℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18 ～24 h；SC 增菌液需在（36±1）℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18 ～24 h[3]。

1.8.3 分離培養(yǎng)

用無菌接種環(huán)挑取增菌后的TTB 增菌液和SC 增菌液各一環(huán)，分別劃線接種BS 平板，沙門氏顯色培養(yǎng)基平板。兩種平板菌在（36±1）℃環(huán)境下培養(yǎng)，其中BS 平板需要培養(yǎng)40 ～48 h，而沙門顯色培養(yǎng)基平板需要培養(yǎng)18 ～24 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落總數(shù)的結(jié)果

菌落總數(shù)檢驗結(jié)果如表2，因為菌落總數(shù)的計數(shù)方法是取30 ～300 CFU 菌落數(shù)，只有稀釋度為10-3的平板在計數(shù)范圍內(nèi)，所以結(jié)果為5×104CFU·mL-1。

表2 菌落總數(shù)實驗結(jié)果表

2.2 大腸菌群計數(shù)的結(jié)果

大腸菌群計數(shù)結(jié)果如表3，因為大腸菌群計數(shù)方法是取15 ～150 CFU 菌落數(shù)，只有稀釋度為10-2的平板在計數(shù)范圍內(nèi)，所以通過計算得到了7 550 CFU·mL-1的檢測值，經(jīng)過第3 位數(shù)字“四舍五入”的修約后得到了7.6×103CFU·mL-1的結(jié)果。

表3 大腸菌群計數(shù)實驗結(jié)果表

2.3 沙門氏菌的結(jié)果

2.3.1 樣品S34 的結(jié)果

經(jīng)過mini-VIDAS 進行初篩得到了陽性的結(jié)果，結(jié)合劃線后的亞硫酸鉍瓊脂平板上生長黑色有金屬光澤菌落，菌落周圍培養(yǎng)基呈棕色；沙門顯色培養(yǎng)基上生長淡紫色圓形菌落，以上現(xiàn)象均是沙門氏菌的可疑現(xiàn)象，需要進一步做生化試驗。三糖鐵瓊脂的結(jié)果為斜面產(chǎn)堿變紅，底層產(chǎn)酸變黃，產(chǎn)氣，產(chǎn)硫化氫；賴氨酸脫羧酶試驗結(jié)果為陽性，兩個試驗結(jié)果可初步判斷為可疑沙門菌屬。筆者運用了API 和VITEK2-Compact 兩種方法進行了確證，反饋的結(jié)果都是Salmonellagroup 99%，結(jié)果可見圖1、圖2。同時還做了血清試驗，O 多價和H 多價血清均凝集。因此樣品S34 的結(jié)果報告是檢出了沙門氏菌。

圖1 樣品S34 API20E 的結(jié)果圖

圖2 樣品S34 VITEK2 的結(jié)果圖

2.3.2 樣品S78

經(jīng)過mini-VIDAS 進行初篩得到了陰性的結(jié)果，見表4，結(jié)合劃線后的亞硫酸鉍瓊脂平板上未見菌落生長；沙門顯色培養(yǎng)基上生長藍色圓形菌落，以上現(xiàn)象可判斷為未檢出沙門氏菌。因此樣品S78 的結(jié)果報告是未檢出沙門氏菌。

表4 Mini VIDAS 結(jié)果表

2.4 結(jié)果反饋

2020 年食品安全抽檢監(jiān)測工作承檢機構(gòu)微生物檢驗實驗室間比對結(jié)果如表5。

表5 2020 年食品安全抽檢監(jiān)測工作承檢機構(gòu)微生物檢驗實驗室間比對情況表

3 結(jié)論

參加本次室間比對的實驗室共有44 家，其中有4家的結(jié)果為不滿意，有2 家的結(jié)果為基本滿意，其余的38 家實驗室反饋結(jié)果均為滿意。出現(xiàn)不滿意結(jié)果的實驗室，有3 家都是在考核沙門氏菌出現(xiàn)假陰性或假陽性的結(jié)果；剩下1 家是在大腸菌群計數(shù)時結(jié)果超出考核范圍。沙門氏菌檢驗出現(xiàn)的問題可以能是因為消毒工作沒做好、操作人員判斷典型菌落時出現(xiàn)了偏差而沒有進行下一步鑒定或是挑取錯誤、樣品前處理時沒做好導(dǎo)致實驗失敗等。因此，在對待可疑樣品時應(yīng)采取多種方法來鑒定，以免造成錯檢或漏檢[4]。

在進行沙門氏菌檢驗時，應(yīng)在增菌后通過mini-VIDAS 進行初篩，如果出現(xiàn)陽性的結(jié)果應(yīng)更加謹慎的對待該樣品。mini-VIDAS 檢測方法既快速準確又可以避免人工檢測造成的誤差，與傳統(tǒng)方法互補[5]，不過檢驗費用較為昂貴。在后續(xù)的鑒定中筆者實驗室會使用傳統(tǒng)方法同時再結(jié)合API 法和VITEK2-Compact 兩種方法來確證，API 法能夠提高檢測效率還能彌補傳統(tǒng)方法的不足[6]；全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)在實操中會更加便利，生化結(jié)果準確而且快速。雖然相對人工進行的傳統(tǒng)生化試驗這兩種方法成本都更高，但是檢測時間更短，而且結(jié)果影響因素更少，得到的結(jié)果更加準確可靠。通常會用這兩種方法來互相確證試驗結(jié)果，如果結(jié)果存在較大偏差時，應(yīng)及時重做試驗發(fā)現(xiàn)問題。