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        超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜檢測玉米中 5 種真菌毒素的方法研究

        2021-03-11 08:20:18郝國輝
        現(xiàn)代食品 2021年1期
        關鍵詞:方法

        ◎ 郝國輝

        (江蘇省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗測試中心,江蘇 南京 210036)

        糧食在種植、收獲、加工、運輸和儲存過程中易被真菌感染而產(chǎn)生真菌毒素,這些真菌毒素隨著糧食及其制品進入食物鏈,最終可能引起人或動物的致癌、致畸等病變[1]。我國玉米由于后期處理及儲存條件的原因,真菌毒素的污染較為嚴重[2]。黃曲霉毒素B1(AFB1)是迄今發(fā)現(xiàn)的毒性最強的真菌毒素;伏馬毒素主要是由串珠鐮刀菌屬真菌產(chǎn)生的一類強毒和致癌性真菌毒素,其中伏馬毒素B1(FB1)是代表性成分之一;脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)又名嘔吐毒素,目前對糧食污染最為普遍[3];玉米赤霉烯酮(ZEN)化學性質(zhì)穩(wěn)定,高溫下難分解,嚴重威脅肉類生產(chǎn)的安全和人類健康[4]。玉米中DON 和AFB1容易動態(tài)積累,AFB1受生育期影響較大;ZEN 含量變化比較平穩(wěn)[5]。鑒于QuECHERS 技術與超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)相結(jié)合的優(yōu)勢[6-8],為了同時檢測玉米中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、3-乙?;撗跹└牭毒┐迹?-AcDON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、黃曲霉毒素B1(AFB1)和伏馬毒素B1(FB1)這5 種真菌毒素,本文對幾種提取方法進行了驗證和比對,期望獲得一種方便快捷、準確可靠的檢測方法。

        1 材料與方法

        1.1 實驗材料

        1.1.1 儀器與設備

        Waters TQS 高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Waters 公司)、PL602E 梅特勒電子天平(梅特勒-托利多公司)、TG16-WS 離心機(湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司)、振蕩器(Talboys 公司)。

        1.1.2 材料與試劑

        脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、3-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(3-AcDON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、黃曲霉毒素B1(AFB1)及伏馬毒素B1(FB1)5 種標準溶液,購自Dr 公司;乙腈、乙酸銨、甲酸,均為色譜純,購自Merk 公司;Agilent 5982-6650 萃取包,購自Agilent 公司;CNW SBEQ-CA8805-H 凈化管,購自德國CNW 科技公司;0.22 μm 濾膜,購自天津市津騰實驗設備有限公司。

        1.2 樣品提取

        (1)方法1。準確稱取5.0 g 試樣(精確到0.01 g)于50 mL 離心管中,加入10 mL 提取劑(含1%甲酸的50%乙腈水溶液),振蕩提取5 min,7 000 r·min-1條件離心5 min;取1.5 mL 上清液,加入凈化管渦旋1 min,7 000 r·min-1,離心5 min;取1 mL 上清液,氮吹至近干,用提取液定容至1 mL,過0.22 μm 的濾膜后,樣品用于UPLC-MS/MS 上機測定。

        (2)方法2。準確稱取5.0 g 試樣(精確到0.01 g)于50 mL 離心管中,加入10 mL 提取劑(含0.1%甲酸的80%乙腈水溶液),振蕩提取40 min,加入QuEChERS 萃取包,振搖2 min 使其全部分散,7 000 r·min-1條件下離心5 min,取1.0 mL 上清液于凈化管中,振蕩提取1 min 后12 000 r·min-1條件下離心5 min,取上清液過0.22 μm 的濾膜,樣品用于UPLC-MS/MS 上機測定。

        (3)方法3。準確稱取5.0 g 試樣(精確到0.01 g)于50 mL 離心管中,加入10 mL 乙腈,振蕩提取10 min,7 000 r·min-1條件下離心5 min,取1.0 mL 上清液加入到凈化管中,振蕩提取1 min 后12 000 r·min-1條件下離心5 min,取上清液過0.22 μm 的濾膜后,樣品待測;余下樣品管取2.0 ml 上清液置于50 ℃水浴中氮吹至至近干,用50%乙腈水溶液定容至1.0 mL。兩份樣品同時用于UPLC-MS/MS 上機測定。

        1.3 儀器條件

        1.3.1 色譜條件

        色譜柱ACQUITY BEH C181.7 μm(2.1 mm×50 mm),柱溫為40 ℃;進樣體積為1.0 μL;流動相A 為5 mmol·L-1乙酸銨水溶液(含0.01%甲酸),流動相B 為乙腈溶液;流速為0.30 mL·min-1;梯度洗脫,梯度洗脫程序見表1。

        表1 超高效液相色譜的梯度洗脫程序表

        1.3.2 質(zhì)譜條件

        離子源為電噴霧電離正離子模式(ESI+);多反應監(jiān)測掃描(MRM);脫溶劑溫度為500 ℃;其他質(zhì)譜參數(shù)見表2。

        表2 5 種待測真菌毒素的質(zhì)譜參數(shù)及條件表

        1.3.3 標準溶液

        5 種毒素標準溶液逐級依次稀釋成相應濃度(DON、3-AcDON、FB1濃度為0.2 mg·L-1、0.4 mg·L-1、0.6 mg·L-1和0.8 mg·L-1,ZEN 濃 度 為0.02 mg·L-1、0.04 mg·L-1、0.06 mg·L-1、0.08 mg·L-1和0.10 mg·L-1,AFB1濃度為0.002 mg·L-1、0.004 mg·L-1、0.006 mg·L-1、0.008 mg·L-1和0.010 mg·L-1),作為標準曲線工作溶液,獲得5 種毒素標準曲線及線性相關系數(shù)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 3 種提取方法結(jié)果比對

        DON、3-AcDON、ZEN 3 種毒素用50%、80%、100%乙腈提取溶劑提取效率均為80%以上,100%乙腈提取效率更優(yōu)。AFB1使用含水提取溶劑提取效率不穩(wěn)定且提取率較低;FB1使用純乙腈提取凈化后直接上機,沒有任何檢出,再次使用含50%乙腈水復溶后,檢測得到的回收率為80%以上。3 種提取方法提取后回收率情況見表3。

        表3 3 種提取方法提取后回收率情況表

        根據(jù)3 種提取方法的結(jié)果比對,最終選擇最優(yōu)化的提取方法3。

        2.2 方法檢出限與方法定量限

        在1.3 儀器條件下,得到5 種毒素的總離子流如圖1 所示。

        分別使用逐步稀釋法[9]得到5 種毒素的方法檢出限并以此評估得到方法的定量限,見表4。

        2.3 方法準確度確認

        分別對5 種毒素的定量限、2 倍定量限和10 倍定量限進行添加試驗[10],得到結(jié)果表5,通過結(jié)果分析可見DON 的回收率在74%~90%,3-AcDON 的回收率在74%~90%,ZEN 的回收率在74%~90%,AFB1的 回 收 率 在74% ~90%,F(xiàn)B1的 回 收 率 在74%~90%。符合實驗室質(zhì)量控制規(guī)范[10]。

        圖1 5 種毒素的總離子流圖

        表4 UPLC-MS/MS 測定5 種毒素的線性方程、方法檢出限及方法定量限表

        表5 五種毒素在莧菜中的回收率和標準偏差表

        3 結(jié)論

        本實驗采用乙腈提取玉米中5 種常見真菌毒素,同時采用超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法進行檢測。該方法方便、快捷且準確度高,可應用于玉米中5 種常見真菌毒素的檢測。

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