◎ 張麗敏,劉印歡,左麗娜,高 騰
(石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司,河北 石家莊 050000)
有害微生物是導(dǎo)致食品風(fēng)險(xiǎn)的主要因素。微生物的種類有非常多,并且存在超強(qiáng)的變異性,微生物檢測(cè)手段也一直在進(jìn)步。隨著近幾年分子生物學(xué)的快速發(fā)展,具備超強(qiáng)特異性、靈敏度等優(yōu)點(diǎn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR 技術(shù)),已經(jīng)成為食品有害微生物檢測(cè)的一種常規(guī)方法。目前,很多生物制品公司利用傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)原理設(shè)計(jì)了不同的檢測(cè)儀器,同時(shí),微生物檢測(cè)應(yīng)當(dāng)向著快速、自動(dòng)化方向發(fā)展,PCR 已經(jīng)作為一種新的檢測(cè)方法在一些行業(yè)和地區(qū)得到了應(yīng)用。與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比,PCR 技術(shù)檢驗(yàn)速度快、特異性強(qiáng)、靈敏度高,可以減少對(duì)微生物培養(yǎng)的依賴,因此也逐漸成為食品檢驗(yàn)中的常用方法。
PCR 技術(shù),全稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),是通過對(duì)溫度的控制,從而在體外擴(kuò)增出大量靶DNA 片段,該技術(shù)可將靶DNA 片段在短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增到十萬甚至是百萬倍。PCR 技術(shù)具備超強(qiáng)的特異性,它的原理是和DNA 的自然復(fù)制過程類似。通過溫度的變化控制DNA 的變性、復(fù)性,完成DNA 體外復(fù)制。PCR 體外復(fù)制過程主要包含以下3 個(gè)步驟,①變性。溫度在一定時(shí)間內(nèi)保持在94 ℃左右,雙鏈DNA 會(huì)解離成單鏈。②復(fù)性。將溫度降低,保持在55 ℃左右,引物與單鏈DNA 結(jié)合。③延伸。通過TaqDNA 聚合酶的作用,將dNTP 作為反應(yīng)原材料,合成和模板DNA 互補(bǔ)的一條新鏈。然后重復(fù)循環(huán)以上步驟,1 h 內(nèi)即可完成大量DNA 的合成。一般情況下,PCR 技術(shù)的檢驗(yàn)速度比傳統(tǒng)模式更有優(yōu)勢(shì)。
沙門氏菌是一類主要寄生在人和動(dòng)物腸道中的微生物,屬于革蘭氏陰性桿菌,其生化反應(yīng)和人體的抗原結(jié)構(gòu)有關(guān)。受污染的水是沙門氏菌感染的主要來源。沙門氏菌會(huì)導(dǎo)致人類和動(dòng)物疾病,人類疾病的主要包括傷寒和敗血癥。沙門氏菌SP-1 的毒性很低,但是在菌體裂解過程中產(chǎn)生的強(qiáng)毒性的內(nèi)毒素,會(huì)迅速侵入宿主細(xì)胞,從而危害人體健康。目前,invA、invb、hila、FIMA、16S rRNA 是沙門氏菌檢測(cè)的主要靶基因。
單核細(xì)胞增生李斯特菌生長(zhǎng)的溫度范圍為2~42 ℃,主要存在于污水和腐爛蔬菜中。它很容易通過食品和糞便傳播。這種微生物是一種細(xì)胞內(nèi)寄生細(xì)菌。單核細(xì)胞增生性李斯特菌感染早期常表現(xiàn)為非典型感冒樣癥狀,臨床表現(xiàn)為敗血癥、腦炎等,也可能導(dǎo)致流產(chǎn)。單核細(xì)胞增生李斯特菌的毒力基因主要包括LIPI-1 和UPI-2,最常用的檢測(cè)基因是hly-A、inl-A 和ACT-A。
副溶血性弧菌是嗜鹽菌,3.5%的NaCl 最合適微生物生長(zhǎng)。副溶血性弧菌致病性的關(guān)鍵在于它與宿主細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生相互作用。例如,TDH 的微生物可以使人或兔子的紅細(xì)胞產(chǎn)生神奈川現(xiàn)象。但是這些基因在環(huán)境中很少被檢測(cè)到。
阪崎腸桿菌培養(yǎng)要求低,不形成孢子。這種微生物和單核增生李斯特菌相類似,其主要危害是引發(fā)人體腦膜炎和敗血癥。這兩種病癥的易感人群為早產(chǎn)兒和低出生體重兒這類抵抗力很弱的新生兒群體,因此其對(duì)新生兒的健康威脅還是很大的。阪崎腸桿菌感染不常發(fā)生,但嬰兒感染所帶來的風(fēng)險(xiǎn)是致命的,主要是附著在腸道組織上,通過血腦屏障導(dǎo)致嬰兒腦細(xì)胞死亡。阪崎腸桿菌的分子檢測(cè)主要是用ITS 基因和16S rRNA 兩種基因進(jìn)行測(cè)定。
目前沒有針對(duì)金黃色葡萄球菌的疫苗。金黃色葡萄球菌營養(yǎng)要求不高,空氣、水、灰塵和人畜排泄物都中可能存在。臨床上重要的毒力基因包括luks/f-pv基因和TST 基因。
微生物采樣需要做好有效的執(zhí)行方法,確定了采樣方案之后,采樣方法的有效執(zhí)行和樣品的有效性在一定程度上與最后的檢驗(yàn)結(jié)果有關(guān)。
現(xiàn)場(chǎng)采樣過程需要規(guī)范操作,所有的采樣工具都應(yīng)該是經(jīng)過高壓滅菌的,以避免一切污染,容器需要干燥清潔、大小合適,采樣過程中,應(yīng)采取必要的措施防止食品中固有微生物的數(shù)量和生長(zhǎng)能力發(fā)生變化,確保檢樣的代表性。若取樣的是固體食品,也需要根據(jù)相關(guān)的管理辦法,不破壞產(chǎn)品的代表性。若取樣的是液體,應(yīng)當(dāng)在取樣之前搖晃或者攪拌,將其混合均勻,通常情況下需要將樣品冷卻到0 ~4 ℃,再進(jìn)行檢驗(yàn)。
生產(chǎn)過程中的取樣中,應(yīng)當(dāng)注意其隨機(jī)性和無菌性,以車間的用水取樣為例,要從各個(gè)水龍頭上取樣,若進(jìn)行車間衛(wèi)生監(jiān)測(cè),應(yīng)當(dāng)在保證水龍頭表面干燥的基礎(chǔ)上,用無菌稀釋液潤(rùn)濕棉簽擦拭龍頭表面,若檢測(cè)空氣狀況,則在車間的四角和中部分別放置平皿蓋,暴露采樣檢驗(yàn)。
以牛奶樣品的基因組提取與檢驗(yàn)分析為例進(jìn)行分析,操作步驟應(yīng)當(dāng)符合《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。
脂肪的密度較小,自然情況下會(huì)出現(xiàn)輕微的上浮,為了提升檢驗(yàn)效率,一般會(huì)采用高速離心的方式實(shí)現(xiàn)脫脂。取乳品樣品10 mL,將樣品放置到LB 液體培養(yǎng)基中,充分混合,使用機(jī)器高速離心,時(shí)間設(shè)置為5 min,然后去除上層的脂肪。然后放入115 ℃的環(huán)境中高溫滅菌,將微生物全部殺死,避免出現(xiàn)分裂影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的問題。在制備的樣品中加入2 μL 蛋白酶,去除蛋白質(zhì),取10 μL 0.5 mol·L-1的EDTANa2溶液加入樣品中,以上流程完成之后,應(yīng)離心2 min 最后用滅菌生理鹽水清洗。
對(duì)分離株和產(chǎn)物的序列結(jié)果進(jìn)行分析,以Gen Bank 公布的序列結(jié)果進(jìn)行比照,分析其微生物的保守區(qū)序列和測(cè)序結(jié)果是否一致。
用相同的引物和反應(yīng)條件在無乳鏈球菌、沙門氏菌、無乳鏈球菌等DNA 中擴(kuò)增,如果得不到已知的DNA 擴(kuò)增片段,則證明了PCR 檢驗(yàn)的單一性。牛奶樣品的宏基因組的測(cè)定,主要進(jìn)行普通PCR 和qPCR 兩項(xiàng)檢測(cè)。以沙門氏菌為例,如果未添加細(xì)菌的牛奶加標(biāo)樣品在連續(xù)梯度稀釋下產(chǎn)生明顯的擴(kuò)增曲線,最后將樣品放置在置有緩沖蛋白胨水中,在37 ℃的環(huán)境下培養(yǎng),培養(yǎng)結(jié)果表明,部分沙門氏菌污染樣品能被有效檢測(cè)。
經(jīng)PCR 檢測(cè)得出單位食品樣品中的微生物含量情況后,需要分析檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù),并判定食品樣品是否合格,判斷方法主要有以下2 種。
二級(jí)法是根據(jù)樣品數(shù)量(n)、不合格品儲(chǔ)糧(c)、國家規(guī)定的合格判定標(biāo)準(zhǔn)(m)進(jìn)行判斷,超過m值即為不合格品。例如生海產(chǎn)品,n=5,c=0,m=102,n=5,即取5 個(gè)樣品,c=0 表示該批樣品中未發(fā)現(xiàn)超過m值的樣品,則說明該產(chǎn)品合格。
二級(jí)法是根據(jù)樣品數(shù)量(n)、不合格品儲(chǔ)糧(c)、國家規(guī)定的合格判定標(biāo)準(zhǔn)(m)與判定為合格的菌數(shù)限量(M)進(jìn)行判斷,m、M這兩個(gè)量是相互關(guān)聯(lián)的,如果m不符合標(biāo)準(zhǔn)則直接不合格,如果m符合標(biāo)準(zhǔn)但是M不符合標(biāo)準(zhǔn),則也是不合格。這一標(biāo)準(zhǔn)更加嚴(yán)格,以某批產(chǎn)品為例,n=5,c=3,m=101,M=102,這其中可以有小于等于3 個(gè)樣品的菌種數(shù)量在m~M,如果有3 個(gè)以上的菌種在m~M,或者其中有任何一個(gè)超過M值,就說明這批產(chǎn)品不合格。
總而言之,隨著時(shí)代的發(fā)展,食品安全問題應(yīng)當(dāng)?shù)玫接行Ы鉀Q,高效精準(zhǔn)的食品檢驗(yàn)技術(shù)在當(dāng)下具有很強(qiáng)的研究意義,而保證食品中微生物的檢驗(yàn)的科學(xué)性、安全性,具有深刻的研究?jī)r(jià)值,為了達(dá)到提升食品安全質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的目的,應(yīng)當(dāng)做好微生物檢測(cè)的深度研究,保證食品檢驗(yàn)工作質(zhì)量,保障大眾的身體健康。