樊有存，張紅巖，韓 芊，楊旭升，武學(xué)霞，劉玉皎

(1.青海大學(xué)，青海 西寧 810016； 2.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，青海 西寧 810016；3.省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海大學(xué)，青海 西寧 810016；4.青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，青海 西寧 810016)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR (real-time quantitative PCR，RT-qPCR)是當(dāng)前研究基因表達(dá)水平的主要技術(shù)手段[1]。為了準(zhǔn)確檢測(cè)目的基因的表達(dá)情況，一般會(huì)選用一個(gè)或多個(gè)表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)參基因進(jìn)行校正[2-3]。目前，植物種常用的內(nèi)參基因有α/β微管蛋白基因(TUA，TUB)、參與胞質(zhì)核糖體小亞基及翻譯因子(18SrRNA)、肌動(dòng)蛋白基因(ACT)、蛋白合成中的翻譯延伸因子(GAPA)、轉(zhuǎn)錄延伸因子基因(EF1a)及蛋白質(zhì)加工代謝相關(guān)的親環(huán)蛋白(CYP)等[4-7]。但實(shí)際上，在不同的細(xì)胞、組織、生理階段，目的基因的表達(dá)量可能存在差異[8]，亦會(huì)因所選用的內(nèi)參基因的不同而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。近年來(lái)，關(guān)于豆科植物內(nèi)參基因的報(bào)道有很多。王驍?shù)萚9]篩選出CYP2和GAPDH為大豆籽粒發(fā)育過(guò)程中表達(dá)最為穩(wěn)定的基因，UKN2和TUB4為胚軸中表達(dá)穩(wěn)定的基因，而ACT2和CYP2為子葉中表達(dá)穩(wěn)定的基因，逆境脅迫下UKN2、TUB4、EF1A較穩(wěn)定。付媛媛等[10]發(fā)現(xiàn)，紫花苜蓿在各種脅迫(激素、鹽脅迫、干旱和暗條件)下不同組織中表達(dá)量相對(duì)比較穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)镸SC27、18SrRNA、EF-La和Actin2。

土壤鹽漬化已成為影響植物生長(zhǎng)發(fā)育和作物產(chǎn)量的主要因素之一，中國(guó)約20%耕地面積受到土壤鹽漬化的影響[11]。蠶豆(ViciafabaL.)作為中國(guó)重要的食用豆類作物之一，具有糧、飼、菜、肥、藥兼用和深加工增值等特點(diǎn),且蠶豆能適應(yīng)冷涼氣候，并有較強(qiáng)的抗鹽堿能力，同時(shí)還有“生物固氮之王”的譽(yù)稱，是種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整中重要的養(yǎng)地作物和間套作物[12-14]。為了充分發(fā)揮蠶豆的多元化功能及生態(tài)價(jià)值，其種植區(qū)域不斷擴(kuò)大，而土壤鹽漬化將成為制約蠶豆生產(chǎn)的主要因素之一。

篩選蠶豆在鹽脅迫下的合適內(nèi)參基因是研究耐鹽基因表達(dá)特性的必要前提，目前，有關(guān)蠶豆鹽脅迫方面的研究主要集中在鹽脅迫對(duì)蠶豆生長(zhǎng)、生理響應(yīng)及提高蠶豆耐鹽性的理化方法等[15-16]方面。Gutierrez 等[17]以不同的組織、基因型和接種幾種常見(jiàn)病原體的蠶豆為試驗(yàn)材料，篩選出ACT1、CYP2和ELF1A可作為相對(duì)合適的內(nèi)參基因，而蠶豆在鹽脅迫下不同組織中適宜的內(nèi)參基因篩選方面的研究尚未報(bào)道。本研究以不同氯化鈉濃度脅迫下的蠶豆葉、莖和根為材料，篩選6個(gè)植物常用候選內(nèi)參基因(ELF1A、ACT2、GAPA、18SrRNA、TUA和CYP2)，利用Ct值分析及內(nèi)參基因分析軟件(GeNorm、NormFider和BestKeeper)分析評(píng)估候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，由此篩選出蠶豆鹽脅迫下不同組織中能穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，為以后研究蠶豆耐鹽功能基因提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

(1)材料培養(yǎng)。本試驗(yàn)以篩選獲得的耐鹽蠶豆種質(zhì)2014-04為材料(青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院蠶豆課題組提供)。用5%NaClO消毒處理種子，利用植物光照培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)10 d后選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗移至裝有等量石英砂的塑料盆中并放置培養(yǎng)箱 (25 ℃/18 ℃)(白天/夜晚)，相對(duì)濕度(70±5)%，光照周期16 h/8 h(白天/夜晚)，光照強(qiáng)度250 μmol/m2/s[18]，待完全長(zhǎng)出真葉后，分別以0、50、100、150 mmol/L氯化鈉溶液于每天固定時(shí)間對(duì)蠶豆幼苗進(jìn)行脅迫處理，培養(yǎng)7 d后對(duì)各濃度處理下蠶豆幼苗的根、莖和葉進(jìn)行取樣并置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)試劑及儀器。試劑：植物總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根生化科技有限公司)；Reverse Transcriptase M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa)、TB Green Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)酶(TaKaRa)。儀器設(shè)備：梯度PCR儀(Veriti SimpliAmp ProFlex 96，ABI)、低溫高速離心機(jī)(Centrifuge 5430 R，Eppendorf )、超微量核酸蛋白測(cè)定儀(Implen NP80 Mobile，Implen)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(LightCycler?480，Roche)等。

1.2 試驗(yàn)方法

(1)RNA提取及cDNA合成。取50～100 mg蠶豆組織，利用天根植物總RNA提取試劑提取總RNA(RNA用DNase處理去除基因組DNA污染)；利用超微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定總RNA濃度、純度，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。用質(zhì)量合格的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，在-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)合成引物及RT-qPCR分析。試驗(yàn)選用的ACT2、18SrRNA、TUA、GAPA、CYP2和ELF1A六個(gè)候選內(nèi)參基因[17,19]來(lái)源于已發(fā)表的蠶豆候選內(nèi)參基因及其近緣植物中不同組織、不同非生物脅迫下篩選出的相對(duì)表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因(表 1)。引物由天津金唯智生物科技有限公司合成。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀LightCycler?480，采用TB Green Ⅱ試劑盒進(jìn)行RT-qPCR分析。程序設(shè)定為95 ℃預(yù)變性30 s，1個(gè)循環(huán)；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃，5 s，60 ℃，1 min，進(jìn)行溶解曲線分析；50 ℃降溫30 s，實(shí)驗(yàn)設(shè)定3個(gè)重復(fù)。

表1候選內(nèi)參基因RT-qPCR引物序列Tab.1 RT-qPCR primer sequences of candidate reference genes

(3)數(shù)據(jù)處理與分析。分別利用GeNorm、NormFider和Bestkeeper軟件分析候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性，篩選出在鹽脅迫下蠶豆不同組織中適宜的內(nèi)參基因。GeNorm和NormFider軟件的計(jì)算原理相似，都需將原始Ct值轉(zhuǎn)換為相對(duì)表達(dá)量(Q=2-ΔΔCt)后計(jì)算出穩(wěn)定系數(shù)M值，并通過(guò)M值來(lái)評(píng)價(jià)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。一般默認(rèn)閾值M=1.5，當(dāng)M>1.5時(shí)，基因不穩(wěn)定；當(dāng)M<1.5時(shí),可以考慮作為內(nèi)參基因。且M值越小，基因的穩(wěn)定性越高，反之越低。GeNorm軟件亦可通過(guò)變異系數(shù)V值來(lái)確定適宜內(nèi)參基因的數(shù)目，當(dāng)Vn/Vn+1<0.15時(shí)，表明有n個(gè)內(nèi)參基因即可滿足實(shí)驗(yàn)要求。BestKeeper軟件則直接對(duì)原始Ct值進(jìn)行計(jì)算，通過(guò)計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)、相關(guān)系數(shù)(r)及變異系數(shù)(CV)來(lái)選擇表達(dá)穩(wěn)定性較好的內(nèi)參基因。其中r值越大，CV和SD就越小，內(nèi)參基因的穩(wěn)定性越好，反之，穩(wěn)定性就越差；而當(dāng)SD>1時(shí)，表示該內(nèi)參基因表達(dá)不穩(wěn)定[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1蠶豆樣品總RNA的提取及檢測(cè)利用植物總RNA提取試劑提取在不同濃度NaCl處理過(guò)的蠶豆幼苗的葉、莖和根的總RNA?？俁NA濃度檢測(cè)結(jié)果顯示：A260/A280為2.138～2.275 (表2)，且葉片總RNA濃度在1 000 ng/μL左右，根與莖的總RNA濃度為303.12～650.84 ng/μL，表明總RNA的質(zhì)量較好；1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)蠶豆幼苗葉、莖和根分別在0 mmoL/L、50 mmoL/L、100 mmoL/L和150 mmoL/L NaCl脅迫下的總RNA結(jié)果顯示 (圖1)，28SrRNA、18SrRNA的條帶清晰明亮， 5SrRNA條帶較暗，這說(shuō)明所提取的RNA未降解，完整性較好，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

表2不同鹽濃度下蠶豆不同組織的總RNA質(zhì)量和純度檢測(cè)Tab.2 Total mass of RNA and purity testing of faba bean tissues under the different concentrations of NaCl

圖1 蠶豆不同組織的總RNA電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results of total RNA in the different tissues of faba bean

2.2內(nèi)參基因的特異性分析圖2為1%瓊脂糖溶液凝膠電泳檢測(cè)候選內(nèi)參基因普通PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)果，圖中1、2、3、4、5、6 分別為TUA、 18SrRNA、CYP2、ELF1A、GAPA和ACT2 六個(gè)候選內(nèi)參基因PCR產(chǎn)物的電泳條帶，均為單一條帶，無(wú)引物二聚體和非特異性條帶，且產(chǎn)物大小均為100～250 bp。在此基礎(chǔ)上，利用RT-qPCR技術(shù)驗(yàn)證6對(duì)引物，結(jié)果顯示候選內(nèi)參基因的溶解曲線都表現(xiàn)為單一信號(hào)峰(圖3)。以上分析結(jié)果表明，各候選內(nèi)參基因的引物特異性較好，可用于后期分析。

圖2 6對(duì)引物在鹽脅迫下蠶豆不同組織PCR電泳檢測(cè)Fig.2 PCR analysis with 6 pairs of primers in the different tissues of faba bean under the salt stress

圖3 鹽脅迫下蠶豆不同組織中6個(gè)內(nèi)參基因 RT-qPCR 溶解曲線Fig.3 RT-qPCR dissolution curves of 6 reference genes in the different tissues of faba bean under the salt stress

2.3 候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析

圖4 六個(gè)候選內(nèi)參基因在鹽脅迫下蠶豆不同組織中的表達(dá)豐度Fig.4 Abundance of expressions of 6 candidate reference genes in the different tissues of faba bean under the salt stress

(1)候選內(nèi)參基因表達(dá)豐度分析。內(nèi)參基因的Ct值是衡量某一基因表達(dá)量的主要指標(biāo)，Ct值越大,基因表達(dá)量越低；反之越高[20]。本試驗(yàn)所篩選的六個(gè)候選內(nèi)參基因在蠶豆樣品中表達(dá)豐度較高，Ct值在10～35(圖4)。其中ELF1A基因Ct值范圍為10.85～12.89，在根、莖、葉中表達(dá)量最高；而TUA基因Ct值范圍為29.47～35.73，在根、莖、葉中的表達(dá)量最低。ELF1A、ACT2及18SrRNA三個(gè)基因在根莖葉中的表達(dá)量較穩(wěn)定，而GAPA基因在根中表達(dá)量較低，在莖和葉片中的表達(dá)量較高。

(2)GeNorm軟件分析結(jié)果。GeNorm軟件分析結(jié)果顯示(圖5)，鹽脅迫下蠶豆不同組織中六個(gè)候選內(nèi)參基因平均表達(dá)穩(wěn)定系數(shù)M值均小于1.5。葉中候選內(nèi)參基因的平均表達(dá)穩(wěn)定性為ACT2>18SrRNA>GAPA>ELF1A>CYP2>TUA；莖中候選內(nèi)參基因的平均表達(dá)穩(wěn)定性為CYP2>ACT2>GAPA>ELF1A>18SrRNA>TUA；根中候選內(nèi)參基因的平均表達(dá)穩(wěn)定性為CYP2>ELF1A>18SrRNA>ACT2>TUA>GAPA。本次研究結(jié)果表明，在鹽脅迫下蠶豆葉中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因?yàn)锳CT2和18SrRNA，莖中相對(duì)穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因是CYP2、ACT2，根中相對(duì)穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因是CYP2和ELF1A。另外，從配對(duì)變異系數(shù)(V)可以看出Vn/Vn+1值均小于0.15(圖6)，表明在鹽脅迫下的蠶豆不同組織中選取兩個(gè)內(nèi)參基因就可以得到準(zhǔn)確結(jié)果。

圖5 GeNorm軟件分析內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性Fig.5 Expression stability of reference genes analyzed via GeNorm

圖6 GeNorm 分析候選內(nèi)參基因的配對(duì)變異值Fig.6 Paired variation of reference genes analyzed via GeNorm

(3)NormFinder 軟件分析。從NormFinder軟件分析結(jié)果得出(表3)，在鹽脅迫下蠶豆葉中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是ACT2和18SrRNA，在莖中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是CYP2，在根中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是CYP2和ELF1A。

表3 NormFinder 軟件分析結(jié)果Tab.3 Analysis results of NormFinder

(4)BestKeeper 軟件分析結(jié)果。BestKeeper軟件分析結(jié)果(表4)顯示，除TUA以外的候選基因的標(biāo)準(zhǔn)差(SD)均小于1.5，說(shuō)明所選候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定較好。鹽脅迫下蠶豆葉中ACT2基因表達(dá)最穩(wěn)定，莖和根中CYP2基因表達(dá)最穩(wěn)定。該結(jié)果與GeNorm和NormFinder軟件分析的結(jié)果大致相同，部分差異可能由于軟件間的計(jì)算原理不同所導(dǎo)致。

表4 BestKeeper 軟件分析結(jié)果Tab.4 Analysis results of BestKeeper

3 討論與結(jié)論

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是研究基因表達(dá)變化的主要手段，為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，RT-qPCR需要選用表達(dá)較為穩(wěn)定的持家基因來(lái)控制樣品間的非特異性變異[21]。然而，近年來(lái)研究結(jié)果表明，并未有表達(dá)絕對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)參基因，即使在同一物種或組織中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，其穩(wěn)定性會(huì)因?qū)嶒?yàn)條件的影響而表現(xiàn)出差異性[22-23]。因此，篩選出在不同物種、不同組織中適宜的內(nèi)參基因就顯得十分重要。Gutierrez等[17]以不同組織、基因型和接種幾種重要的病原體的蠶豆為研究對(duì)象，進(jìn)行內(nèi)參基因的篩選，結(jié)果顯示ACT1基因、CYP2基因和ELF1A基因可作為理想的內(nèi)參基因。本研究以不同鹽濃度脅迫下的蠶豆不同組織為材料，對(duì)六個(gè)植物常見(jiàn)的候選內(nèi)參基因進(jìn)行篩選，結(jié)果表明，在鹽脅迫下的蠶豆葉片中，ACT2和18SrRNA基因表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，在莖中CYP2基因表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，而根中CYP2和ELF1A基因表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定?；贕eNorm、NormFinder和BestKeeper 軟件分析候選內(nèi)參基因的結(jié)果存在一些差異，可能由于軟件間的計(jì)算原理不同所導(dǎo)致(GeNorm軟件和NormFinder軟件利用相對(duì)表達(dá)量Q來(lái)計(jì)算內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值，而B(niǎo)estKeeper軟件直接利用原始Ct值進(jìn)行計(jì)算)。由于在試驗(yàn)過(guò)程中，內(nèi)參基因表達(dá)量也會(huì)受到樣品質(zhì)量的影響。因此，在試驗(yàn)過(guò)程中確保樣本RNA、cDNA等的質(zhì)量、純度及操作細(xì)節(jié)的準(zhǔn)確性是確保得到穩(wěn)定內(nèi)參基因的基礎(chǔ)。本研究篩選的鹽脅迫下蠶豆不同組織中穩(wěn)定的內(nèi)參基因，為后期研究蠶豆耐鹽基因表達(dá)分析方面奠定了理論基礎(chǔ)。