胡英杰，沈 碩*，賈鵬莉，陳菲兒

(1.青海大學，青海 西寧 810016； 2.青海大學農(nóng)林科學院，青海 西寧 810016；3.青海省馬鈴薯育種重點實驗室，青海 西寧 810016；4.青藏高原生物技術教育部重點實驗室,青海 西寧 810016)

馬鈴薯干腐病是馬鈴薯儲藏期和生長期常見的病害，該病由一種或多種鐮刀菌共同作用引起[1]，發(fā)病后會使貯藏期的損失最高達到60%。部分鐮孢菌能產(chǎn)生毒素和其他類型的次生代謝產(chǎn)物，如鐮孢菌素A和B、萎蔫酸、脫氫萎蔫酸、串珠菌素、赤霉素等。這些有害的次級代謝產(chǎn)物不僅危害人畜[2]，還會嚴重地制約我國馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前，對馬鈴薯干腐病的防治主要以化學藥劑為主，但化學防治會造成環(huán)境中常見的3R問題[3-4]。因此，微生物源生防制劑的研究以及應用，受到國內(nèi)外學者的廣泛關注[5-6]。

國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)對蘋果環(huán)腐病和梨貯藏病害具抑制活性[7-8];枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)對辣椒炭疽病和小麥根腐病具有抑制活性[9-10];貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)對小麥赤霉病具有抑制活性[11]。嗜鹽菌是一種可在高鹽的極端環(huán)境下生存的菌株類群，根據(jù)其最適生長鹽度劃分，中度嗜鹽菌的最適生長鹽度為3%～15%[12-13]。與輕度嗜鹽菌和極端嗜鹽菌相比，中度嗜鹽菌環(huán)境適應能力相對突出，分布更加廣泛，營養(yǎng)要求相對較低[14-15]，從而可以將其發(fā)展為新型的生防制劑。生長在極端環(huán)境下的嗜鹽芽孢桿菌，在長期的進化選擇和環(huán)境選擇壓力下，形成了特殊的環(huán)境適應機制和基因類型[16]，可能會產(chǎn)生某些具有生物學活性的代謝產(chǎn)物以及其獨特的種群特點。目前，中度嗜鹽菌抑制馬鈴薯干腐病病原菌的研究較少，本文選取本課題組前期從青海茶卡鹽湖地區(qū)樣品中分離純化的部分嗜鹽菌菌株，進行抑制馬鈴薯窖藏病原菌活性的篩選及活性菌株的鑒定，并對其發(fā)酵液萃取物的抑菌活性進行研究，期望從中發(fā)現(xiàn)具有抑制馬鈴薯窖藏病害新活性的嗜鹽菌菌株，為進一步防治馬鈴薯窖藏病害提供新的生防制劑和生防菌劑，并為馬鈴薯干腐病的防治提供新的生防途徑。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試病原菌 供試馬鈴薯病原菌青9A-4-13和青9A-5-10分離自青薯9號病薯薯塊，由青海大學農(nóng)林科學院生物技術研究所提供，純化后保存至4 ℃冰箱。

1.1.2 供試中度嗜鹽菌 21株中度嗜鹽菌菌株分離自茶卡鹽湖湖水和湖泥樣品，由青海大學農(nóng)林科學院生物技術研究所提供，純化后保存至4 ℃冰箱。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基[17]：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂18 g、蒸餾水定容至1 000 mL，pH 7.0。LB培養(yǎng)基[18]：牛肉膏5.0 g 、蛋白胨10.0 g、NaCl 5 g、蒸餾水定容1 000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的活化 將分離純化后的中度嗜鹽菌劃線接種于LB培養(yǎng)基上，平板倒置放入37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d。將保存的馬鈴薯窖藏病原菌青9A-4-13和青9A-5-10接種于PDA培養(yǎng)基，4～7 d 后用6 mm的打孔器在菌落邊緣切下菌餅，用小鑷子將菌餅接種至PDA培養(yǎng)基，于28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d。

1.2.2 中度嗜鹽菌抑制馬鈴薯干腐病病原菌活性菌株的篩選 采用平板對峙法[19],用6 mm的打孔器在培養(yǎng)7 d的病原菌青9A-4-13和青9A-5-10上打孔，將切下的菌餅置于PDA 培養(yǎng)基中央。同時，以十字劃線法，在距離菌落邊緣3 cm處上下左右分別點接接種中度嗜鹽菌菌株，每處理重復3次，放置于28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，觀察生長情況，計算抑制率公式為：

抑制率=(C-T)/C×100%

式中：T為處理組菌落直徑(mm)；C為對照組菌落直徑(mm)。

1.2.3 活性菌株穩(wěn)定性的評價 將初篩得到的活性菌株分別與病原菌對峙培養(yǎng)7 d和14 d后,測量活性菌株的抑菌帶寬度，且計算14 d抑菌帶寬度縮小率，確定活性菌株的穩(wěn)定性。計算公式如下：

抑菌帶寬度縮小率=(S7-S14)/S7×100%

式中：S7為7 d抑菌帶寬度值，S14為14 d抑菌帶寬度值。

菌株穩(wěn)定評價標準：抑菌帶寬度縮小率≥70%為不穩(wěn)定，用“-”表示；50%≤抑菌帶寬度縮小率<70%為較不穩(wěn)定，用“-”表示；20%≤抑菌帶寬度縮小率<50%為較穩(wěn)定，用“+”表示；抑菌帶寬度縮小率<20%為穩(wěn)定，用“++”表示。

1.2.4 中度嗜鹽菌萃取物的制備 將活化好的嗜鹽菌菌株接入裝有800 mL LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，放置于搖瓶柜中，在37 ℃下，以180 r/min的轉(zhuǎn)速，振蕩培養(yǎng)7 d，收獲發(fā)酵液。分別用正己烷、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇挨次對該嗜鹽菌菌株發(fā)酵液進行等體積萃取，萃取液經(jīng)減壓濃縮，獲得不同有機溶劑的萃取物。

萃取物經(jīng)DMSO(<0.1%)預溶，用無菌水分別將不同萃取物配制成濃度100 mg/mL的萃取物溶液，溶液經(jīng)無菌濾紙過濾后，備用。

1.2.5 中度嗜鹽菌提取物對馬鈴薯干腐病病原菌的抑制作用 采用生長速率法[20]，將4種萃取相溶液加入PDA液體培養(yǎng)基，混合均勻后倒入培養(yǎng)皿中，使其終濃度為2、5、10 mg/mL。用直徑6 mm的打孔器切下病原菌菌餅，接種至PDA平板中，置于培養(yǎng)箱中37 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，每處理重復3次。計算抑制率，公式如下：

抑制率=(C-T)/C×100%

式中：T為處理組菌落直徑(mm)；C為對照組菌落直徑(mm)。

1.2.6 活性菌株形態(tài)鑒定 取經(jīng)活化的菌株，觀察菌株生長的菌落形態(tài)特征(形狀、大小、光澤、隆起形狀、透明度、邊緣等)及菌體形態(tài)特征(包括革蘭氏染色、芽孢形態(tài)及運動性)對菌株進行形態(tài)學鑒定。

1.2.7 活性菌株的生理生化特征 參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[21]以及《伯杰氏細菌鑒定手冊(第8版)》[22]對菌株進行革蘭氏染色、甲基紅、吲哚、厭氧生長、接觸酶、糖、醇類發(fā)酵、過氧化氫酶、硝酸鹽還原、明膠液化等生理生化特征的鑒定。

1.2.8 活性菌株的分子生物學鑒定 活性菌株A10201的DNA提取，采用生工生物工程(上海)股份有限公司的柱式細菌DNA提取試劑盒的程序操作。選擇細菌的16S rDNA通用引物F27 (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGG-3′)和P1541(5′-AAGGAGGTGGTGATCCAGCCG CA-3′)。PCR 擴增體系：10×Buffer 2.5 μL，dNTP (10 mol/L) 2 μL，模板DNA 1 μL，引物各1 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，水補足至25 μL。PCR反應條件：94 ℃ 5 min，變性94 ℃ 40 s，退火55 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 80 s，35個循環(huán)，72 ℃ 10 min。反應結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測(由生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序)。所得到的16S rDNA序列在網(wǎng)站https://www.ezbio cloud.net/上進行序列對比，通過MEGA 7.0軟件，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 中度嗜鹽菌抑制馬鈴薯干腐病病原菌活性菌株的篩選

采用平板對峙法，對21株中度嗜鹽菌抑制馬鈴薯干腐病病原菌的活性進行測定。結(jié)果顯示，其中有9株嗜鹽菌對馬鈴薯干腐病病原菌具有較高的抑制活性，菌株A10201和A20105對病原菌均表現(xiàn)出較強的抑制作用(表1)。在平板對峙7 d后，菌株A10201對青9A-4-13、青9A-5-10的抑制率分別為41.74%和50.93%，菌株A20105對青9A-4-13、青9A-5-10抑制率分別為50.73%和52.37%，該兩株嗜鹽菌的抑制效果較其他嗜鹽菌顯著。比較該兩種嗜鹽菌對馬鈴薯干腐病病原菌青9A-4-13、青9A-5-10的抑制率發(fā)現(xiàn)，嗜鹽菌對青9A-5-10的整體抑制率更高，將青9A-5-10作為靶標病原菌。

表1中度嗜鹽菌對馬鈴薯干腐病病原菌的抑制活性Tab.1 Inhibitory activity of moderate halophiles on the pathogenic bacteria of potato dry rot

2.2 中度嗜鹽菌抑制穩(wěn)定性評價

通過抑菌活性的初篩，得到兩株抑菌活性最高的拮抗菌，為了確定它們抑菌活性的穩(wěn)定性，進行復篩和抑制作用穩(wěn)定性的評價，結(jié)果如表2所示。從表2可知，菌株A20105雖然具有較高的抑制活性，但抑制穩(wěn)定性表現(xiàn)較差，在第14天時抑菌帶寬度縮小率為63.04%，而菌株A10201在第14天時抑菌帶寬度縮小率為13.94%，表現(xiàn)出更高的穩(wěn)定性。因此，在活性菌株形態(tài)鑒定以菌株A10201為主。

表2中度嗜鹽菌對馬鈴薯病原菌青9A-5-10抑制穩(wěn)定性Tab.2 Inhibition stability of moderate halophiles on potato pathogens Qing 9A-5-10

2.3 菌株A10201和A20105發(fā)酵液萃取物抑菌作用

表3為生長速率法對發(fā)酵液萃取物的抑菌作用測定結(jié)果，從表3可知,菌株A10201和A20105的發(fā)酵液萃取物對指示病原菌均有抑制活性。隨著發(fā)酵液萃取物濃度的升高，病原菌菌落半徑逐漸減小，而對病原菌抑菌率升高，在10 mg/mL濃度下時均達到最高的抑制率。其中，在10 mg/mL濃度下，菌株A10201的乙酸乙酯、正己烷、氯仿、正丁醇萃取物對病原菌的抑菌率分別達71.10%、46.59%、71.60%、78.57%。菌株A20105在10 mg/mL濃度下，乙酸乙酯、正己烷、氯仿、正丁醇萃取物對病原菌的抑菌率達62.50%、38.34%、67.44%、79.85%。結(jié)果均表明正丁醇萃取物的抑菌活性最高。

表3中度嗜鹽菌發(fā)酵液提取物對馬鈴薯病原菌青9A-5-10的抑制率Tab.3 Inhibition rate of broth extracted from moderate halophiles on potato pathogens Qing 9A-5-10

2.4 菌株A10201的鑒定

2.4.1 菌株A10201的形態(tài)學鑒定 在 LB 固體培養(yǎng)基平板上，A10201菌落呈乳白色，邊緣不整齊，直徑2～6 mm，細胞呈桿狀，能在20～ 41 ℃條件下生長，革蘭氏染色呈陽性菌(圖1)。

圖1 菌株A10201的培養(yǎng)性狀及革蘭氏染色特征Fig.1 Culturural characteristics and Gram staining characteristics of strain A10201

2.4.2 菌株A10201的生理生化特征 菌株A10201的生理生化特征結(jié)果如表4所示。

表4菌株A10201的生理生化特性Tab.4 Physiological-biochemical characteristics of strain A10201

由表4可知，革蘭氏染色、硝酸鹽還原試驗、過氧化氫酶試驗、厭氧生長試驗、接觸酶試驗、明膠液化試驗、乙酰甲基甲醇試驗、甲基紅試驗、淀粉水解試驗呈陽性，檸檬酸鹽、吲哚、溶菌酶試驗呈陰性。此外,菌株A10201能利用葡萄糖、果糖、蔗糖，但不能利用乳糖。

2.4.3 菌株A10201的分子生物學鑒定及其系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 將菌株A10201測序得到的16S rDNA序列提交至網(wǎng)址(https://www.ezbiocloud.net/)與數(shù)據(jù)庫中已知的16S rDNA序列進行比較，并下載與菌株A10201的16S rDNA序列同源性大于95%的序列，使用Mega(7.0)軟件，根據(jù)Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。結(jié)合菌株A10201的形態(tài)特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析結(jié)果，最終將菌株A10201鑒定為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)，Genbank登錄號為MF157551。

圖2 菌株A10201基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain A10201 based on 16S rDNA sequence

3 結(jié)論與討論

隨著大量微生物農(nóng)藥的開發(fā)與應用，生物防治已成為一個熱門的研究領域[23]。本研究經(jīng)過抑菌活性初篩，得到兩株對馬鈴薯干腐病具有較高抑制活性的中度嗜鹽菌菌株A10201和A20105。穩(wěn)定性評價結(jié)果顯示，菌株A10201的穩(wěn)定性更高，更具有應用價值。經(jīng)鑒定，菌株A10201為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)，地衣芽孢桿菌屬于枯草芽孢桿菌近緣種[24-25]，芽孢桿菌是一種存在廣泛的非致病生防菌，對人畜健康，環(huán)境適應力強，極具生防潛力。由于其性能穩(wěn)定、易于貯存是真菌病害防治中應用最多的生防微生物。

本研究通過發(fā)酵萃取試驗得出正丁醇相萃取物對指示病原菌抑菌作用最好，在10 mg/mL濃度下抑菌率達78.57%。其抑菌機理可能是在代謝過程中產(chǎn)生大量抗菌物質(zhì)，如抗菌蛋白、幾丁質(zhì)酶等[26]，該類蛋白類物質(zhì)主要作用于致病菌的細胞壁、細胞膜，所以在真菌類病害上的應用較多[27]?；蛘?，地衣芽孢桿菌產(chǎn)生拮抗作用，與病原菌競爭營養(yǎng)與空間等來抑制病原菌的生長，并誘導寄主植物本身產(chǎn)生抗性以及對寄主植物的促生作用等。由此可知，地衣芽孢桿菌A10201的抑菌機理還有待進一步研究。同時，研究結(jié)果表明該地衣芽孢桿菌A10201對馬鈴薯干腐病具有較強抑制作用，對環(huán)境適應能力強，具有較強的生防效果。此研究結(jié)果將為防止馬鈴薯窖藏病害和馬鈴薯保鮮制劑的開發(fā)提供科學理論依據(jù)和技術支持。