杜芳英，朱春暉，鄧春雷，陳 濤，熊業(yè)城，胡成虎，俞小瑞

(1. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，陜西西安 710061；2. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部環(huán)境與基因教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，陜西西安 710061)

隨著電子信息化社會的飛速發(fā)展以及人類壽命延長等因素影響，視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病患病率越來越高，嚴(yán)重影響人類生存質(zhì)量，是目前全世界都較為關(guān)注的重要社會公共衛(wèi)生問題之一。年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration, AMD)是臨床上常見的視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病[1]，其病因復(fù)雜，臨床缺少有效治療方案。研究提示，AMD表現(xiàn)為自由基清除能力下降，同時伴有炎性因子升高[2]。因此，激活感光細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化蛋白可以延緩AMD的進(jìn)展，并為AMD提供治療策略。

17β-雌二醇(17β-estradiol, βE2)是體內(nèi)循環(huán)最豐富、最有效的人類雌激素，并被公認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的強(qiáng)抗氧化劑[3]。神經(jīng)膜多不飽和脂肪酸的豐富性增加了脂質(zhì)對氧化損傷的敏感性。因此，近年來，βE2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中抗氧化神經(jīng)保護(hù)作用是神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[4]。βE2已被證明可以預(yù)防腦損傷和神經(jīng)退行性疾病，例如阿爾茨海默病和帕金森病[5-6]。視網(wǎng)膜是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的外延，雌激素對視網(wǎng)膜主要細(xì)胞都顯示出保護(hù)作用[7]，但仍不清楚其中詳細(xì)的抗氧化分子機(jī)制。

NF-E2相關(guān)因子2(NF-E2-related factor 2, Nrf2)屬堿性亮氨酸拉鏈的轉(zhuǎn)錄因子家族，其介導(dǎo)的抗氧化信號通路是細(xì)胞內(nèi)重要的防御途徑[8]。Nrf2的激活受到多個級別的嚴(yán)格調(diào)節(jié)，Nrf2激活后調(diào)控Ⅱ相抗氧化酶的表達(dá)，包括超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1, SOD1)、SOD2、過氧化氫酶(catalase, CAT)、硫氧還蛋白1(thioredoxin 1, Txn1)、Txn2、谷氧還蛋白(glutaredoxin 1, Glrx 1)及Glrx 2。本研究利用光誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜退行性變大鼠模型，檢測βE2玻璃體腔給藥后視網(wǎng)膜功能的變化，以及Nrf2及其下游抗氧化基因的表達(dá)，為βE2在視網(wǎng)膜變性疾病(如AMD)的臨床治療提供實(shí)驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物雌性SD大鼠，體質(zhì)量(250±10)g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部SPF動物研究中心提供。本實(shí)驗所有的動物操作都參照西安交通大學(xué)動物實(shí)驗中心的飼養(yǎng)和實(shí)驗動物使用指南進(jìn)行。動物實(shí)驗前2周行卵巢切除術(shù)，以限制內(nèi)源性雌激素的干擾。所有大鼠首先暗適應(yīng)18 h，接著按體質(zhì)量腹腔注射100 g/L水合氯醛麻醉，進(jìn)行分組干預(yù)。βE2光損組(βE2-LD組)玻璃體腔注射4 μL βE2、生理鹽水光損組(Saline-LD組)玻璃體腔注射4 μL生理鹽水，并立即進(jìn)行熒光燈(強(qiáng)度為8 000-lux)照射12 h，與此同時Saline組(鹽水組，Control)和βE2組分別經(jīng)玻璃體腔注射Saline、βE2 4 μL后，未進(jìn)行熒光燈照射；光損傷組(LD組)僅進(jìn)行了熒光燈照射12 h。最后各組所有大鼠暗恢復(fù)1 d，再進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.2 視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram, ERG)大鼠麻醉后眼球表面滴加復(fù)方托吡卡胺滴眼液進(jìn)行擴(kuò)瞳。大鼠平趴于工作支架上，接好負(fù)極和接地電極后，兩側(cè)角膜電極接觸放置于大鼠眼角膜中央，力度輕柔，以剛剛接觸角膜為宜，行視桿細(xì)胞反應(yīng)(Rod-ERG)和最大混合反應(yīng)(Max-ERG)測試。

1.3 標(biāo)本取材及免疫熒光檢測大鼠麻醉后，將含有5 μmol/L 2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2,7-dichlorodi-hydrofluorescein diacetate, DCFH-DA，Sigma產(chǎn)品)的平衡鹽灌注液行心臟灌注20 min。將分離得到的眼球浸入40 g/L多聚甲醛中過夜后去前節(jié)，暴露硬固晶體并取出。剩余的眼杯浸入20%～25%的蔗糖中，約2～3 h后眼球沉入杯底。提前將冰凍切片機(jī)打開，設(shè)置溫度-25 ℃。滴少許OCT包埋劑于冷凍頭上，并使得視神經(jīng)長軸與水平面平行，扶穩(wěn)眼杯，待下層完全凍住后松手，緩慢在其上面滴加OCT包埋劑，使眼杯剛好完全浸泡在其中即可。待組織及包埋劑完全硬固后開始修切組織，切片厚10 μm，貼片于多聚賴氨酸黏附的載玻片。隨后經(jīng)5 μg/mL的DAPI孵育后加抗熒光淬滅劑，激光共聚焦顯微鏡(Confocal)下觀察拍照。DAPI激發(fā)波長340 nm，發(fā)射波長488 nm；DCF激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm。

1.4 免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry, IHC)檢測大鼠眼球經(jīng)梯度乙醇脫水，石蠟包埋，經(jīng)組織切片機(jī)獲得組織切片(厚度5 μm)。常規(guī)復(fù)性后，使用免疫組化試劑盒(武漢博士德)，將切片與Nrf2(稀釋1∶60，Abcam)在37 ℃孵育2 h后，將生物素偶聯(lián)的二抗孵育20 min，然后再進(jìn)行SABC處理30 min。使用DAB顯色劑試劑盒顯色，蘇木精復(fù)染。

1.5 實(shí)時定量PCR(Real-time PCR)使用Trizol試劑(Invitrogen，美國)從大鼠視網(wǎng)膜提取總RNA，隨后用First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas，加拿大)將2 μg的RNA反轉(zhuǎn)錄，通過使用iQ5(Bio-Rad，美國)和SYBR Premix ExTaqTMⅡ(TaKaRa，日本)檢測基因mRNA表達(dá)情況。各基因的引物信息見表1。

表1 Real-time PCR中基因的引物信息Tab.1 Primer of genes for Real-time PCR

2 結(jié) 果

2.1 光損傷后大鼠視網(wǎng)膜功能的變化ERG檢測光損情況下大鼠視網(wǎng)膜功能變化，結(jié)果顯示，LD組的視網(wǎng)膜Rod-ERG和Max-ERG均較Control組a波、b波振幅明顯減小(表2)。提示大鼠在光損傷后，視網(wǎng)膜功能受損嚴(yán)重，可為本研究提供較理想的視網(wǎng)膜退行性變模型。

表2 ERG檢測光損傷后大鼠視網(wǎng)膜功能的變化Tab.2 Changes of rat retinal function after LD detected by ERG (n=6)

2.2 光損后大鼠視網(wǎng)膜組織活性氧水平及抗氧化基因mRNA表達(dá)變化Confocal觀察結(jié)果顯示，與正常去勢SD大鼠視網(wǎng)膜相比，光損傷后視網(wǎng)膜組織DCF熒光強(qiáng)度顯著升高，主要分布在外節(jié)(OS)、內(nèi)節(jié)(IS層)(圖1A)。Real-time PCR結(jié)果顯示，8 000 lux白光刺激SD大鼠12 h經(jīng)暗恢復(fù)1 d后，與正常去勢SD大鼠視網(wǎng)膜組織相比，光損傷后視網(wǎng)膜組織的Sod1、Sod2、Cat、Glrx1、Glrx2、Txn1和Txn2的mRNA表達(dá)顯著降低(圖1B)。提示8 000 lux白光刺激去勢SD大鼠12 h確實(shí)損害了視網(wǎng)膜組織的內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)。

圖1 光損傷后視網(wǎng)膜組織氧化應(yīng)激水平的變化Fig.1 The level of oxidative stress in retinal tissue after LDA：DCFH-DA免疫熒光染色結(jié)果；B：抗氧化基因mRNA表達(dá)的統(tǒng)計分析。與Control組比較，*P<0.05(n=6)。OS：外節(jié)；IS：內(nèi)節(jié)；ONL：外核層；INL：內(nèi)核層；GCL：神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層。

2.3 βE2處理可減少ROS產(chǎn)生并增加Ⅱ相抗氧化酶的表達(dá)大鼠經(jīng)玻璃體腔預(yù)注射βE2后行光損刺激，熒光探針DCFH-DA測量ROS生成。Confocal觀察結(jié)果顯示，Saline-LD組的大鼠具有較高的ROS熒光強(qiáng)度，而βE2-LD組的ROS熒光強(qiáng)度則明顯降低；玻璃體腔注射βE2可以顯著上調(diào)Sod1，Sod1，Cat，Glrx1，Glrx2，Txn1和Txn2的mRNA表達(dá)(圖2)。

圖2 經(jīng)玻璃體腔預(yù)注射βE2對視網(wǎng)膜組織的氧化應(yīng)激的影響Fig.2 Changes of oxidative stress in retinal tissue after βE2 administrationA：DCFH-DA檢測ROS(×400)；B：Real-time PCR檢測抗氧化基因mRNA表達(dá)的比較。*P<0.05(n=6)。

2.4 βE2可上調(diào)視網(wǎng)膜組織中Nrf2的表達(dá)免疫組化染色結(jié)果顯示，Saline-LD組在應(yīng)激條件下，也在一定程度上激活了視網(wǎng)膜細(xì)胞Nrf2的表達(dá)，其中主要集中在內(nèi)核層(INL)層，而βE2-LD組內(nèi)INL、外核層(ONL)層細(xì)胞Nrf2的表達(dá)都顯著升高(圖3)。

圖3 免疫組化檢測βE2經(jīng)玻璃體腔預(yù)注射給藥后視網(wǎng)膜Nrf2的表達(dá)及定位Fig.3 Expression and localization of Nrf2 after βE2 administration detected by immunohistochemistry與Saline-LD組相比，*P<0.05(n=6)。

2.5 βE2對光損傷后視網(wǎng)膜功能的影響ERG檢測視網(wǎng)膜功能的結(jié)果顯示，大鼠經(jīng)玻璃體腔單獨(dú)注射Saline或βE2，視桿細(xì)胞反應(yīng)和最大混合反應(yīng)a、b波振幅沒有明顯變化，Saline-LD組與Saline組或βE2組相比，其a、b波振幅均明顯降低；與Saline-LD組相比，βE2-LD組a、b波振幅均明顯回升(表3)。提示光損傷可影響視網(wǎng)膜功能，而在光損前預(yù)注射βE2可一定程度使視網(wǎng)膜功能得以恢復(fù)。

表3 ERG檢測βE2給藥后視網(wǎng)膜功能的變化Tab.3 Retinal function detected by ERG after βE2 administration (n=6)

3 討 論

視網(wǎng)膜退行性變的病因復(fù)雜，是遺傳和環(huán)境等因素共同作用所導(dǎo)致的復(fù)雜性疾病，臨床缺少有效的治療方法。因此，逆轉(zhuǎn)神經(jīng)視網(wǎng)膜變性的治療方法具有廣泛應(yīng)用前景，常用的治療方法主要有干細(xì)胞治療、基因治療和神經(jīng)保護(hù)治療。其中神經(jīng)保護(hù)治療機(jī)制是通過為視網(wǎng)膜組織提供神經(jīng)營養(yǎng)因子、抑制凋亡信號通路等途徑而實(shí)現(xiàn)[9]。氧化應(yīng)激在視網(wǎng)膜退行性變的病理生理過程中發(fā)揮重要作用，是導(dǎo)致視網(wǎng)膜功能損害的關(guān)鍵機(jī)制之一。因此，越來越多的學(xué)者關(guān)注抗氧化劑在視網(wǎng)膜退行性變中的效用。已有報道一些抗氧化劑如蘿卜硫烷、姜黃素等可顯著降低光誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷風(fēng)險[10-11]。此外，美國臨床評價復(fù)合抗氧化劑的治療效果，結(jié)果顯示補(bǔ)充復(fù)合抗氧化劑超過8年的中期AMD患者，患者轉(zhuǎn)至晚期AMD的發(fā)生率下降25%[12]。

過度光照誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜變性模型由NOELL等[13]于1966年首次建立。視桿細(xì)胞膜盤所含的視紫紅質(zhì)在光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能過程中起著極其關(guān)鍵的作用，因此視紫紅質(zhì)是光損傷中的一個重要因素。研究表明，視網(wǎng)膜光損傷模型中視紫紅質(zhì)的吸收光波長與視網(wǎng)膜損傷光的波長一致，視紫紅質(zhì)的漂白產(chǎn)物如全反式視黃醛的吸收光波長與短波長損傷光的光譜相近。與正常光照環(huán)境飼養(yǎng)的動物相比，暗環(huán)境飼養(yǎng)的動物對光損傷的敏感性更高[14]?；谏鲜鲅芯?，學(xué)者推測該模型建模的理論基礎(chǔ)為：強(qiáng)光刺激引起感光細(xì)胞發(fā)生劇烈的視紫紅質(zhì)漂白循環(huán)，由此產(chǎn)生大量的ROS，當(dāng)機(jī)體無法有效地清除這些毒性產(chǎn)物時，以視桿細(xì)胞為代表的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞便會激活凋亡通路發(fā)生凋亡，最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜功能受損[15]。而且與藥物誘導(dǎo)神經(jīng)退行性疾病模型相比，視網(wǎng)膜光損傷模型優(yōu)點(diǎn)是建?？臁⒛Ｐ头€(wěn)定、全身副作用小。本研究也提示，光損引起SD大鼠視網(wǎng)膜功能顯著降低的同時，視網(wǎng)膜組織內(nèi)產(chǎn)生大量的ROS，因此本模型為研究βE2的抗氧化作用提供很好的研究基礎(chǔ)。

AMD病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚不明了，學(xué)者多認(rèn)為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epithelium, RPE)基底膜兩側(cè)膜性物質(zhì)的沉積在AMD的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。索爾茲伯里眼評估項目評估了激素治療和女性生殖因素對AMD的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)激素治療與晚期AMD玻璃膜疣的形成概率有關(guān)[16]。體外過氧化氫誘導(dǎo)RPE細(xì)胞凋亡模擬AMD模型，觀察到βE2對RPE有顯著保護(hù)作用，同時還可以抑制過氧化氫誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)[17]?？梢?，雌激素不僅可以治療視網(wǎng)膜退行性變和青光眼，對AMD也可能有一定的效果。缺血-再灌注等也可以誘導(dǎo)視網(wǎng)膜退行性視力喪失。研究發(fā)現(xiàn)，βE2從病變早期就開始保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞[18]。學(xué)者也在短暫性缺血性視網(wǎng)膜損傷模型中發(fā)現(xiàn)，βE2可抑制白細(xì)胞聚積，改善視網(wǎng)膜功能[19]。本研究提示，βE2可以激活Nrf2在視網(wǎng)膜外核層和內(nèi)核層的表達(dá)，進(jìn)而為其發(fā)揮視網(wǎng)膜神經(jīng)保護(hù)奠定了基礎(chǔ)。

Nrf2通路顯示出強(qiáng)大的抗氧化潛力，可以預(yù)防與氧化應(yīng)激相關(guān)的多種疾病。Nrf2激活后啟動Ⅱ相解毒酶和相關(guān)抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄，最終提高細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力。本研究發(fā)現(xiàn)，玻璃體腔注射βE2可顯著激活內(nèi)源性抗氧化酶Sod1/2、Cat、Glrx1/2和Txn1/2的mRNA表達(dá)升高，而這些抗氧化基因受Nrf2轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。然而，Nrf2在組織中的表達(dá)水平取決于特定組織解毒程度的需求[20]。在光損傷誘導(dǎo)視網(wǎng)膜變性模型中，Saline-LD組大鼠視網(wǎng)膜Nrf2陽性細(xì)胞主要分布在INL，而βE2預(yù)處理后，Nrf2陽性細(xì)胞數(shù)量在ONL和INL都顯著增加，特別是ONL。據(jù)此推測，INL細(xì)胞在一定程度上激活內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)，βE2主要激活ONL的Nrf2表達(dá)，從而增強(qiáng)視網(wǎng)膜組織清除ROS的能力，其中的具體機(jī)制還需要后期進(jìn)一步研究。

綜上所述，在光損傷誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜退行性變中，βE2可增強(qiáng)視網(wǎng)膜組織清除ROS的能力，上調(diào)抗氧化基因表達(dá)，恢復(fù)視網(wǎng)膜功能。但有關(guān)βE2神經(jīng)保護(hù)作用的具體分子機(jī)制如βE2如何激活Nrf2信號通路，尚需更深入的研究，以期為雌激素在神經(jīng)退行性疾病中的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。