劉景輝，孫倩，王帥，孫冬梅

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

氟磺胺草醚主要用于花生、大豆的芽前芽后使用，高效、低毒、選擇性強(qiáng)[1]，大豆田常用的25%氟磺胺草醚水劑是一種莖葉處理的除草劑，其較長(zhǎng)的半衰期使氟磺胺草醚在連作的土壤中不斷積累，甚至影響到后茬作物的正常生長(zhǎng)，產(chǎn)生藥害[2-4]。此外，該類除草劑長(zhǎng)期的使用會(huì)造成嚴(yán)重的土壤殘留，對(duì)土壤與環(huán)境造成危害，由于其分布于土壤和自然水體[5-6]，不利于用化學(xué)方法解除其危害，而微生物降解可能成為一種比較好的解決方案，化學(xué)方法不利于解除氟磺胺草醚的藥害，微生物降解成為一種比較好的解決方案[7-8]。梁波等[9]從長(zhǎng)期受氟磺胺草醚污染的土壤中分離到Lysiniacillus sp.ZB-1 菌株，高效液相法證實(shí)其對(duì)氟磺胺草醚7 d 降解率為81.32%。吳秋彩等[10]從氟磺胺草醚污染土壤中分離出一株Klebsiella.sp降解菌F-12 菌株，2 d 降解率達(dá)80%以上。楊峰山等[11]從土壤中得到一株P(guān)seudomonas mendocina FB8 菌株，對(duì)氟磺胺草醚的5 d 降解率為86.75%。李陽等[12]也分離出一株能降解氟磺胺草醚的黑曲霉菌。說明利用微生物降解氟磺胺草醚是完全可行的，而且降解效率是非常高。然而，不同菌株存在多種生理特性，所以氟磺胺草醚生物降解的產(chǎn)物是多樣的[13-14]，如果想達(dá)到無害化處理，還需進(jìn)一步進(jìn)行生物測(cè)定，對(duì)氟磺胺草醚敏感的作物及雜草均可作為降解能力檢測(cè)的植物，高世杰等[15]利用玉米、向日葵、高粱作為指示植物，對(duì)氟磺胺草醚的生測(cè)方法進(jìn)行了研究，白杰[16]也對(duì)在氟磺胺草醚危害的土壤的玉米生理指標(biāo)進(jìn)行了研究，證明了氟磺胺草醚生物測(cè)定的可行性，利用生物檢測(cè)法不僅可以檢測(cè)出氟磺胺草醚降解菌的降解力，還可以對(duì)其降解產(chǎn)物的部分特性及菌體對(duì)指標(biāo)生物的影響一并表現(xiàn)出來，結(jié)合高效液相法色譜分析，可準(zhǔn)確測(cè)出微生物的氟磺胺草醚的降解率，以便有針對(duì)性地對(duì)氟磺胺草醚污染的土壤和水體進(jìn)行環(huán)境修復(fù)。試驗(yàn)以玉米為研究檢測(cè)植株，確定其生物測(cè)定方法，并對(duì)分離到的氟磺胺草醚降解菌進(jìn)行生物方法驗(yàn)證及液相檢測(cè)復(fù)合驗(yàn)證，以期為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供有益微生物資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試作物種籽、農(nóng)藥

玉米品種：必祥101（北京化農(nóng)偉業(yè)種子科技有限公司），25%氟磺胺草醚水劑（青島瀚生生物科技股份有限公司）。

1.1.2 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基 （g·L-1）：NaCl 1.0，K2HPO41.5，KH2PO40.5，（NH4）2SO41.0，MgSO40.2，CoCl2·6H2O 0.1，MnCl2·4H2O 0.425，ZnCl20.05，NiCl2·6H2O 0.01，CuSO4·5H2O 0.015，Na2MoO4·2H2O 0.01，Na2SeO4·2H2O 0.01，pH 7.0～7.5[11]。

PDA 培養(yǎng)基，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

1.1.3 供試土樣

分別采自長(zhǎng)期使用氟磺胺草醚的黑龍江省牡丹江市軍馬場(chǎng)大豆田（土樣1）和黑龍江墾區(qū)856 農(nóng)場(chǎng)的大豆田（土樣2），耕層5～20 cm 深的土壤，快速放入無菌牛皮紙袋[11]，陰涼保管。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 氟磺胺草醚10 d 齡玉米苗生物檢測(cè)方法的建立

將砂子過5 mm 篩，烘干，分別配成濃度為A-0、B-0.05、C-0.10、D-0.15、E-0.20、F-0.25、G-0.30 mg·kg-1分裝于發(fā)芽盒中，每一濃度梯度3 次重復(fù)，選取催芽后發(fā)芽勢(shì)整齊一致的玉米種子芽朝上栽種于裝有藥土濃度梯度的發(fā)芽盒內(nèi)，每盒8 株，并給予一致的光照和適宜的水份管理，10 d 后，取地上部分稱重，以藥土濃度為自變量，10 d 齡玉米苗鮮重為因變量建立線性關(guān)系[9-10]。

1.2.2 降解菌的馴化培養(yǎng)與分離

取五支250 mL 錐形瓶，分別裝入適量液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基，第一支加入玻璃珠與氟磺胺草醚水劑，配制成100 mg·L-1的氟磺胺草醚溶液，其余四支錐形瓶不加玻璃珠，以100 mg·L-1氟磺胺草醚濃度遞增梯度配成液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基，高壓蒸汽滅菌，取土樣以10%土樣量接種量放入滅菌的裝有玻璃珠的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)中，置 30 ℃，150 r·min-1，7 d，以 10%的接種量轉(zhuǎn)接到200 mg·L-1氟磺胺草醚濃度液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)7 d，按濃度遞增的順序依次轉(zhuǎn)接，最后采用傾注分離，利用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基分離細(xì)菌，利用PDA 培養(yǎng)基分離真菌[11-12]。

1.2.3 降解菌降解能力的生物檢測(cè)與高效液相檢測(cè)

將25%氟磺胺草醚水劑用液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基稀釋成含量為500 mg·L-1的稀溶液，分裝，滅菌，分別接入馴化分離出的氟磺胺草醚降解菌株，接種量為10%，以不接菌為對(duì)照，置 30 ℃，150 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)，5 d 后將對(duì)照與降解液處理均拌入砂土中，使對(duì)照沙土氟磺胺草醚的濃度為0.30 mg·kg-1，依此稀釋倍數(shù)將接菌的降解液與砂土充分混勻，配成藥土。將玉米種子催芽，選發(fā)芽勢(shì)一致的種子芽朝上栽種于裝有 0.30 mg·kg-1的藥土基質(zhì)上，3 次重復(fù)，給予一致的光照和適宜的水分條件，10 d 后生測(cè)地上部分鮮重。

取500 mg·L-1的氟磺胺草醚溶液各150 mL 分裝于6 支250 mL 錐形瓶中，封口膜封口，滅菌，其中3 支接入對(duì)數(shù)期FCX2 菌體，接種量10%，另3 支設(shè)為對(duì)照，置 30 ℃，150 r·min-1，搖床振蕩培養(yǎng) 5 d 后利用高效液相色譜法檢測(cè)。

高效液相色譜法檢測(cè)條件：儀器型號(hào)SPD-20A，柱溫（℃）室溫，柱型號(hào)C18，梯度方式高壓梯度，檢測(cè)器紫外，波長(zhǎng)（nm）245，積分方法面積歸一法，譜圖文件浙大智達(dá)N2000[19-20]。

1.2.4 FCX2 菌株對(duì)玉米種子萌發(fā)的影響

將 FCX2 菌株發(fā)酵液與清水按 0∶1，1∶50，1∶40，1∶30，1∶20，1∶10，1∶0 配制成 7 個(gè)處理的溶液[22]，分別以培養(yǎng)基和與發(fā)酵液pH 相同的NaOH 溶液作為空白對(duì)照[23]，共 21 個(gè)處理，3 次重復(fù)，每次重復(fù)精選 100 粒玉米種子，用各處理液同時(shí)浸種8 h，然后，將浸種后的玉米種子整齊擺入裝有雙層濕潤(rùn)濾紙的發(fā)芽盒中[15-16]，封蓋保溫保濕，28 ℃，48 h 后計(jì)算玉米種子萌發(fā)率，3 次重復(fù)[15-16]。

1.2.5 FCX2 菌株生長(zhǎng)特性初探

不同溫度下的生長(zhǎng)情況：按10%的接種量接入對(duì)數(shù)期FCX2 菌株培養(yǎng)液于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基內(nèi)，分別放入 20、25、30、35 ℃和 40 ℃，150 r·min-1條件下培養(yǎng)，利用紫外分光光度計(jì)每隔4 h 測(cè)定OD值，波長(zhǎng) 600 nm，3 次重復(fù)[7-8]。

不同pH 下的FCX2 生長(zhǎng)情況：用硫酸或氫氧化鈉將牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基pH 分別調(diào)成5、6、7、8 和9，分別按10%接種量接入對(duì)數(shù)期FCX2 菌株培養(yǎng)液，150 r·min-1條件下培養(yǎng)，并每隔4 h 測(cè)定OD值，3 次重復(fù)[9]。

不同N 源下的FCX2 的生長(zhǎng)情況：基礎(chǔ)無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中分別加等量的牛肉膏、酵母膏和蛋白胨，pH 值 8，30 ℃，150 r·min-1條件下培養(yǎng)，并每隔 4 h測(cè)定 OD 值[17-21]，3 次重復(fù)。

不同C 源下的FCX2 的生長(zhǎng)情況：基礎(chǔ)無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中分別加等量的蔗糖、牛肉膏、可溶性淀粉和葡萄糖，pH 值 8，30 ℃，150 r·min-1條件下培養(yǎng)，并每隔 4 h 測(cè)定 OD 值，3 次重復(fù)[11，13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 氟磺胺草醚殘留量的玉米生苗期測(cè)方法

受藥土濃度的影響，10 d 苗齡玉米苗藥害顯著，隨著藥土濃度的增加，玉米枯斑顯著增加，玉米苗低矮、瘦弱、萎蔫和黃化（圖1），地上部鮮重顯著下降，甚至在0.30 mg·kg-1的藥土濃度上，玉米苗已經(jīng)接近枯死，這也說明了玉米苗對(duì)土壤中氟磺胺草醚是敏感的，可以在一定程度上用來指示土壤中氟磺胺草醚的殘留量。

圖1 不同氟磺胺草醚濃度條件下玉米苗生長(zhǎng)情況Fig.1 Growth of maize seedlings under different concentration of fomesafen

對(duì)不同濃度氟磺胺草醚的玉米苗鮮重進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)：隨著藥土濃度增加，10 d 齡玉米鮮重下降顯著，且不同濃度氟磺胺草醚的玉米苗鮮重變化相對(duì)規(guī)律明顯，一定程度上可適用于對(duì)氟磺胺草醚的殘留檢測(cè)，故以藥土濃度為自變量，10 d 玉米苗地上部分鮮重為因變量，用SPSS 軟件進(jìn)行線性回歸分析，得到一元線性回歸方程：Y=-7.096 x+3.281，R2=0.882，P=0.002≤0.01，自變量變異水平達(dá)到顯著，表明該方法能夠很好的預(yù)測(cè)氟磺胺草醚殘留量對(duì)玉米10 d 苗齡地上部分的影響，從而可以用來指示土壤中氟磺胺草醚的殘留量（圖2）。

圖2 不同氟磺胺草醚濃度條件下玉米苗地上部位鮮重Fig.2 Fresh weight of aboveground part of maize seedling under different concentration of fomesafen

2.2 降解菌株的獲得

傾注法從土樣1 中分離得到一株呈黃色、濕潤(rùn)、小而突起、與培養(yǎng)基結(jié)合不緊密菌落的菌株FCX2，進(jìn)一步劃線分離成純菌落（圖3）。

圖3 氟磺胺草醚降解菌的劃線分離Fig.3 Isolation of fomesafen-degrading bacteria on plate medium

2.3 降解菌株降解能力的生物測(cè)定與高效液相檢測(cè)

由于菌株對(duì)氟磺胺草醚是降解利用還是耐受并不能確定，通過對(duì)比氟磺胺草醚濃度為0.30 mg·kg-1的藥土濃度上生長(zhǎng)的玉米苗試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，利用FCX2 菌株降解過的氟磺胺草醚藥液處理的長(zhǎng)勢(shì)要好很多，枯斑數(shù)量明顯下降，說明FCX2 菌株有利于改善玉米苗的藥害狀況（圖4）。經(jīng)玉米苗鮮重均值比較試驗(yàn)，利用FCX2 菌株降解的藥液種植的玉米苗鮮重（均值1.687 6 g）比對(duì)照（1.509 1 g）增加11.36%，達(dá)顯著水平，在一定程度上改善了玉米苗的藥害狀況。

圖4 10 d 齡玉米苗地上部分生長(zhǎng)情況Fig.4 Growth of aboveground part of 10-day-old maize seedling

色譜圖上顯示出氟磺胺草醚主峰時(shí)間軸上的峰值變化明顯（圖5），表明發(fā)酵液組分上了有明顯變化，依據(jù)面積歸一法，檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照相比FCX2 降解5 d 后，氟磺胺草醚濃度降低了44.86%，說明了FCX2 菌株有較強(qiáng)的降解能力，雖然并不確定降解產(chǎn)物的種類和特性，但結(jié)合生物檢測(cè)結(jié)果，證實(shí)了其在改善氟磺胺草醚殘留方面的應(yīng)用價(jià)值。

圖5 FCX2 菌株處理5 d 后的氟磺胺草醚色譜圖Fig.5 HPLC analysis of fomesafen after 5 days of FCX2 treatment

2.4 FCX2 菌株對(duì)玉米種子萌發(fā)的影響

從玉米種子萌發(fā)試驗(yàn)的結(jié)果可以看出（圖6），玉米種子發(fā)芽率在發(fā)酵液與水配成的 1∶50、1∶40 和1∶30 處理上，比培養(yǎng)基對(duì)照分別高出2.84%、5.78%和3.95%，均達(dá)到顯著水平，比pH 水溶液分別高出3.66%、5.02%和3.33%，均達(dá)到顯著水平，說明FCX2菌株發(fā)酵液在 1∶50、1∶40 和 1∶30 處理上有明顯的促生能力。而隨著各處理混合液中FCX2 菌株發(fā)酵液含量的增加，則玉米種子發(fā)芽率開始緩慢下降，當(dāng)達(dá)到1∶0 的處理后，玉米種子發(fā)芽率已降至最低，僅為41.67%，比培養(yǎng)基對(duì)照降低了50.20%，達(dá)極顯著水平，而對(duì)比于pH 水溶液對(duì)照則差異不顯著，說明pH在發(fā)芽率降低規(guī)律中起了主導(dǎo)作用。

圖6 不同處理對(duì)玉米種子萌發(fā)率的影響Fig.6 Effect of different treatments on corn seed germination rate

2.5 FCX2 的生長(zhǎng)特性初探

不同初始的pH 條件下，F(xiàn)CX2 菌株生長(zhǎng)趨勢(shì)相同，即菌液均在8 h 后達(dá)到最大OD 值，但不同條件下的最大OD 值并不相同，其中該菌最適的pH 為8。圖7 的結(jié)果同樣說明FCX2 菌株在供試pH6-9 范圍內(nèi)該菌均可達(dá)到最大產(chǎn)量，而在pH5 的初始狀態(tài)下，F(xiàn)CX2菌株培養(yǎng)液OD 幾乎不變，菌體生長(zhǎng)接近停止，說明菌體無論是在產(chǎn)量還是在生長(zhǎng)速率上均較低，可能是因?yàn)槌跏嫉乃嵝原h(huán)境對(duì)菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生了抑制作用。

圖7 不同pH 值條件下FCX2 菌株的生長(zhǎng)情況Fig.7 Growth of FCX2 strain under different pH conditions

不同溫度下的培養(yǎng)表明：30 ℃的條件下，F(xiàn)CX2菌株無論在菌體生長(zhǎng)速率還是在菌體最大產(chǎn)量上均較高，表明FCX2 菌株的最適溫度為30 ℃；而在20 ℃和25 ℃條件下，F(xiàn)CX2 菌株菌體生長(zhǎng)速率均很慢，且達(dá)到平穩(wěn)期的時(shí)間較晚，說明溫度越低FCX2生長(zhǎng)速度越慢；當(dāng)培養(yǎng)溫度為35 ℃和40 ℃時(shí)，雖然菌液很快達(dá)到穩(wěn)定期，但明顯可以看出，達(dá)到穩(wěn)定期時(shí)菌液的濃度是很低的，當(dāng)培養(yǎng)溫度達(dá)40 ℃時(shí)菌液濃度較其它溫度都要低，也說明高溫對(duì)此菌有一定的抑制作用（圖8）。

圖8 不同溫度條件下FCX2 菌株的生長(zhǎng)情況Fig.8 growth of FCX2 strain at different temperatures

不同N 源的培養(yǎng)結(jié)果表明：牛肉膏、酵母膏和蛋白胨均可作為FCX2 菌株的氮源，且蛋白胨為氮源時(shí)FCX2 菌株的生長(zhǎng)速率最快，且到穩(wěn)定期時(shí)OD 可達(dá)到1.463 7；酵母膏為氮源時(shí)，菌液達(dá)穩(wěn)定期時(shí)OD 值為1.456 1，但差別并不顯著；牛肉膏為氮源時(shí)，菌液達(dá)穩(wěn)定期時(shí)OD 值為1.384 2，且較上述兩者差異顯著，而從該生長(zhǎng)曲線同樣可看出，該菌的生長(zhǎng)速率也較慢（圖 9）。

圖9 不同氮源條件下FCX2 菌株的生長(zhǎng)情況Fig.9 Growth of FCX2 strain under different nitrogen sources

碳源培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果表明：以葡萄糖為碳源時(shí)，F(xiàn)CX2 菌株生長(zhǎng)速率較快，而牛肉膏為碳源時(shí)，雖然生長(zhǎng)速率略低于葡萄糖，但FCX2 菌株在穩(wěn)定期OD值卻可以達(dá)到最大的1.493 1，但以淀粉為碳源時(shí)，無論生長(zhǎng)速率還是穩(wěn)定期OD 值均要比前三者三種碳源低，綜合考慮認(rèn)為葡萄糖為最適碳源，淀粉最不適于作為FCX2 的碳源（圖10）。

圖10 不同碳源條件下FCX2 菌株的生長(zhǎng)情況Fig.10 Growth of FCX2 strain under different carbon sources

3 討論

玉米作為氟磺胺草醚敏感作物，可用來檢測(cè)氟磺胺草醚的降解能力，試驗(yàn)表明：10 d 苗齡玉米苗的長(zhǎng)勢(shì)隨氟磺胺草醚殘留量的增加而下降，當(dāng)殘留量達(dá)到0.30 mg·kg-1時(shí)，玉米苗基本枯死，與高世杰等[15]、白杰等[16]在氟磺胺草醚的對(duì)玉米毒害作用研究相比，雖然方法有所不同，但具有相同的變化規(guī)律，可作為氟磺胺草醚降解能力的生物檢測(cè)手段，在檢測(cè)氟磺胺草醚的降解能力的同時(shí)，也檢測(cè)出FCX2 菌株及其代謝物是對(duì)玉米生長(zhǎng)特性的綜合影響，通過生物檢測(cè)試驗(yàn)，加有FCX2 菌株的處理上玉米苗的鮮重比未加菌的高出了11.36%，證明FCX2 菌株及其代謝物對(duì)玉米苗的藥害有顯著的改善作用，使玉米苗長(zhǎng)勢(shì)得到顯著恢復(fù)，這與以往僅僅通過高效液相色譜分析檢測(cè)而獲得氟磺胺草醚降解菌，單一追求降解率不同[8-14]，利用生物檢測(cè)法篩選氟磺胺草醚降解菌，充分考慮了其菌株在生長(zhǎng)代謝過程中可能產(chǎn)生的大量未知的代謝成分和菌體本身對(duì)檢測(cè)生物的整體效應(yīng)，使所獲降解菌株更具應(yīng)用前景。盡管生物檢測(cè)法有著諸多優(yōu)點(diǎn)，但生物檢測(cè)手段的干擾因素較多，比如FCX2 菌株本身或其代謝成分對(duì)玉米苗生長(zhǎng)的影響，并不能準(zhǔn)確的反映出FCX2 降解率，需要利用高效液相色譜檢測(cè)，測(cè)得5 d 降解率達(dá)44.86%，與大多數(shù)的已獲得的氟磺胺草醚降解菌相比[8-14]，這樣的結(jié)果并不是很高，但其發(fā)酵液對(duì)玉米苗藥害的改善明顯，可用作為氟磺胺草醚降解菌。通過FCX2 菌株發(fā)酵液對(duì)玉米種子萌發(fā)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其促生能力顯著，亦可作為玉米促生菌來使用，但其發(fā)酵液pH 為9.7，會(huì)導(dǎo)致玉米發(fā)芽率顯著下降，應(yīng)用時(shí)要注意控制使用比例或調(diào)節(jié)pH，這一點(diǎn)與胡凱鳳等[23]的研究規(guī)律也基本保持了一致性。研究FCX2 菌株生長(zhǎng)特性發(fā)現(xiàn)，其最適生長(zhǎng)溫度為30 ℃，但無論在20 ℃，還是40 ℃都能很好的生長(zhǎng)，表明對(duì)溫度的適應(yīng)能力較強(qiáng)；其最適pH 為8，在pH5 的環(huán)境幾乎停止生長(zhǎng)，但在pH6～pH9 的環(huán)境是可以正常生長(zhǎng)的，這說明FCX2 菌株適于一些中性或偏堿的土壤；生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)特性的試驗(yàn)表明，最適碳源為葡萄糖，這與葡萄糖為單糖便于利用也相符[17]，而最適氮源為蛋白胨，是比較適合作為FCX2 菌株氮的來源，為了更有效的發(fā)揮其降解功能，還需進(jìn)一步的研究FCX2 菌株應(yīng)用的條件優(yōu)化、預(yù)防菌體產(chǎn)堿作用對(duì)作物的影響，以便最大程度發(fā)揮其能力。