張夢(mèng)龍，趙璧忱，邢菲菲，羅勝繽，羅春海，付世新

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319）

胎衣不下（Retention of fetal membranes，RFM），是指胎兒胎盤(pán)在產(chǎn)犢后8 到12 h 之內(nèi)沒(méi)有排出，其降低了牛的生產(chǎn)力和繁殖力，對(duì)乳制品業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。已知一些易患RFM 的風(fēng)險(xiǎn)因素，但是由于其多因素病因，故統(tǒng)一的發(fā)病機(jī)制仍然難以尋找。分娩后胎兒胎膜的分離以及排出主要與牛胎盤(pán)的結(jié)構(gòu)和免疫學(xué)變化有關(guān)[3]，而已經(jīng)研究證明類(lèi)固醇激素，妊娠晚期和分娩時(shí)的前列腺素環(huán)境在一定程度上介導(dǎo)了這些變化[4]。近年來(lái)隨著技術(shù)的發(fā)展，研究者們對(duì)于該疾病的研究著手于更為直觀的影響因素上，例如影響胎盤(pán)分離的蛋白質(zhì)[5]，如 FAK[6]、MMPs[5]、VEGFA[7-8]等，影響子宮肌肉收縮的 Ca2+、STIM1 等。在實(shí)驗(yàn)室的前期研究中，發(fā)現(xiàn)在RFM 與NO-RFM 奶牛胎盤(pán)中存在一種潛在的重要差異蛋白—小熱休克蛋白[9]。

熱休克蛋白27（HSP27 或HSPB1）是一種應(yīng)激蛋白，屬于小分子熱休克蛋白家族中的一員，當(dāng)細(xì)胞處于能夠改變蛋白折疊的條件下（例如熱刺激）時(shí)[10]，其表達(dá)水平會(huì)上調(diào)，目前HSP27 可能是研究最深入的小分子熱激蛋白之一。HSP27 于1987 年至1988 年被首次純化和鑒定，在這之后人們很快發(fā)現(xiàn)HSP27具有形成高分子量寡聚物并且能夠磷酸化的能力。幾年后，發(fā)現(xiàn)HSP27 是一種發(fā)揮作用不依賴(lài)于ATP的分子伴侶，其參與了蛋白質(zhì)的折疊機(jī)制，在這一過(guò)程中的主要作用是捕獲和儲(chǔ)存由于應(yīng)激誘導(dǎo)形成的錯(cuò)誤折疊的多肽，以避免其聚集，并間接的促進(jìn)其再折疊或錯(cuò)誤蛋白的降解。Hsp27 也在細(xì)胞骨架組織的控制中扮演了重要角色，并以其抗凋亡和抗氧化特性而聞名。而由于胎盤(pán)的功能是為胎兒提供營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)，因此具有極高的代謝活性，在妊娠過(guò)程中，線(xiàn)粒體數(shù)量增加表明氧代謝可能會(huì)很高，但升高的氧代謝可能會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），其中包括超氧陰離子自由基（O2-）過(guò)氧化氫（H2O2）和極活潑的羥基（OH-）。ROS 能夠破壞細(xì)胞的分子結(jié)構(gòu)，例如核酸，脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，故而可能會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡和（或）觸發(fā)凋亡途徑。而目前已有研究表明，當(dāng)奶牛發(fā)生RFM 時(shí)，胎兒胎盤(pán)與母體胎盤(pán)中過(guò)氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）等與ROS 代謝相關(guān)的酶活性出現(xiàn)極顯著差異[11-12]，這證明奶牛的RFM 與ROS可能有極大的聯(lián)系[13]。

而HSP27 的抗氧化特性也是廣為人知的，該特性是由于其可產(chǎn)生針對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)物和病理環(huán)境的物質(zhì)，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用[14]。研究發(fā)現(xiàn)HSP27 能夠降低細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）和一氧化氮（NO）的水平。而早已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽（GSH）本身具有非常強(qiáng)大的抗氧化能力，同時(shí)有研究者發(fā)現(xiàn)HSP27 能夠調(diào)節(jié)6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PD）的活性[15]，那么當(dāng)奶牛發(fā)生胎衣不下時(shí)，差異表達(dá)的HSP27 在胎盤(pán)之間扮演一種怎樣的角色？其與胎盤(pán)之間的ROS 有怎樣的聯(lián)系？HSP27 是否通過(guò)調(diào)節(jié)G6PD 進(jìn)而影響GSH 的產(chǎn)生？故而實(shí)驗(yàn)對(duì)HSP27 對(duì)RFM 奶牛與正常奶牛胎盤(pán)，以及子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)進(jìn)行了研究探討。

1 材料與方法

1.1 試劑

Western 及IP 細(xì)胞裂解液、蛋白酶抑制劑混合物、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、GSH 和GSSG 檢測(cè)試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶檢測(cè)試劑盒、活性氧檢測(cè)試劑盒、G6PDH 活性檢測(cè)試劑盒，SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒，青霉素-鏈霉素溶液，均購(gòu)買(mǎi)于碧云天生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶-EDTA 消化液，4×蛋白上樣緩沖液均購(gòu)自于上海索萊寶公司；RPMI 1640 液體培養(yǎng)基購(gòu)自于Hyclone 公司；胎牛血清購(gòu)自于四季青公司；Anti-HSP27（Abcam，鼠源，單抗）購(gòu)自于美國(guó)Abcam 公司；Anti-Actin Beta（云克隆，鼠源，單抗）購(gòu)自于中國(guó)武漢云克隆公司；Goat Anti-Mouse（納川，山羊）購(gòu)自于中國(guó)哈爾濱納川生物公司。Si-RNA，siRNA-Mate 轉(zhuǎn)染試劑均購(gòu)自于蘇州吉瑪基因公司；17-AAG 購(gòu)自于上海陶素生化公司。

1.2 樣品采集

在黑龍省某現(xiàn)代化奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行樣品采集，選取一批品系，體況評(píng)分，產(chǎn)次，產(chǎn)奶量都相近的奶牛，并且在其分娩后對(duì)其進(jìn)行消毒及局部麻醉后，手術(shù)采集胎兒胎盤(pán)，并且根據(jù)RFM 判斷標(biāo)準(zhǔn)以及對(duì)奶牛進(jìn)行跟蹤以觀察是否有其他疾病的發(fā)生，最終選取胎衣不下與正常奶牛各7 頭，RFM 記為T(mén) 組，正常組記為C 組；在手術(shù)采集時(shí)應(yīng)注意采集的組織大小適中，采集后立刻使用滅菌生理鹽水沖洗血污，至于液氮中保存，之后迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室至于-80 ℃保存。

1.3 Western Blot

研缽提前滅菌備用，液氮預(yù)冷，剪取適量組織放入其中，使用研杵將其研磨成干粉狀，在此過(guò)程中務(wù)必保證研缽中始終有液氮，用藥匙將干粉倒入EP 管中，加入裂解液提取組織總蛋白，然后使用BCA 測(cè)定盒檢測(cè)蛋白濃度，并將其調(diào)至相同，加入蛋白上樣緩沖液煮沸變性后備用，根據(jù)目的蛋白大小選擇濃度合適的分離膠，按照說(shuō)明書(shū)配制，根據(jù)蛋白濃度調(diào)整上樣量，根據(jù)marker 標(biāo)記切取凝膠，使用半干法轉(zhuǎn)膜，之后使用5%脫脂奶粉封閉，結(jié)束后使用TBST 清洗，選擇相對(duì)應(yīng)的一抗孵育過(guò)夜，之后孵育二抗，每個(gè)步驟之間都需要TBST 清洗，最后使用凝膠成像系統(tǒng)照膜，Image Lab 軟件分析灰度值。

1.4 G6PD、GSH-Px、GSH 和 GSSG 的檢測(cè)

根據(jù)各個(gè)WST-8 試劑盒的說(shuō)明書(shū)，分別檢測(cè)胎衣不下與胎衣正常胎兒胎盤(pán)中G6PD 及GSH-Px 的活性，GSH 和 GSSG 含量。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

奶牛原代子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞來(lái)自于實(shí)驗(yàn)室，子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞在含10%血清，1%青鏈霉素的培養(yǎng)基中，外界環(huán)境為5% CO2以及37 ℃條件下培養(yǎng)。

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用H2O2法已經(jīng)成功建立奶牛子宮內(nèi)膜上皮氧化應(yīng)激模型，并且也通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選了HSP27 過(guò)表達(dá)劑17-AAG[16]的適宜用量；故而進(jìn)行了以下處理：使用17-AAG 對(duì)HSP27 進(jìn)行過(guò)表達(dá)，再使用過(guò)氧化氫溶液處理細(xì)胞；使用未經(jīng)任何處理，并且處于氧化應(yīng)激狀態(tài)下的細(xì)胞作為對(duì)照，使用上述方法檢測(cè)細(xì)胞中HSP27 的表達(dá)，G6PD、GSH-Px 的活性以及ROS、GSH 和GSSG 的含量變化。以上試驗(yàn)每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，并且每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果使用平均值±SEM 表示，使用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行分析，使用單因素ANOVA 方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，“*”表示差異顯著（P＜0.05），“**”表示差異極顯著（P＜0.01）。

2 結(jié)果

2.1 組織總蛋白的提取與濃度測(cè)定結(jié)果

提取組織蛋白后，應(yīng)用BCA 法測(cè)定蛋白濃度，并繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，其中R2=0.993 4≈1，表明得出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)準(zhǔn)確性高。然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出各個(gè)樣品的濃度如表1。

表1 組織樣品總蛋白濃度及吸光度值Table 1 The concentration and OD of protein in the groups

2.2 組織蛋白Western blot 結(jié)果

Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1，使用分析軟件可知HSP27 在胎衣不下奶牛胎兒胎盤(pán)中顯著的上調(diào)（P＜0.05），并且 HSP27 蛋白大量活化。

2.3 組織中G6PD、GSH-Px 活性以及GSH 和GSSG的含量檢測(cè)

由表2 可見(jiàn)，當(dāng)奶牛發(fā)生胎衣不下時(shí)，胎盤(pán)中G6PD 的活性出現(xiàn)顯著性下降（P＜0.05），而 GSH-Px活性則出現(xiàn)相反的結(jié)果，在胎衣不下胎盤(pán)中呈現(xiàn)顯著性上調(diào)（P＜0.05）。

圖 1 HSP27 與 p-HSP27 的 Western Blot 結(jié)果Fig.1 The result of HSP27 and p-HSP27 Western blotting

表2 組織中G6PD 與GSH-Px 的活性Table 2 Activity of G6PD and GSH-Px in the caruncles

由表3 可知，奶牛在正常分娩時(shí)胎盤(pán)中GSH 含量較高，GSSG 含量較低，而當(dāng)奶牛發(fā)生胎衣不下時(shí)GSH 含量與正常相比呈現(xiàn)顯著性降低（P＜0.05），GSSG 含量顯著性增高（P＜0.05）。

表3 胎盤(pán)中GSSG 與GSH 的含量Table 3 Content of GSSG，GSH in the caruncles

2.4 過(guò)表達(dá)HSP27 對(duì)牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

2.4.1 過(guò)表達(dá)HSP27 后，其在氧化應(yīng)激下的表達(dá)量

由圖2 可以得知，實(shí)驗(yàn)成功的對(duì)HSP27 進(jìn)行了過(guò)表達(dá)。

2.4.2 過(guò)表達(dá)HSP27 對(duì)牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞ROS 含量的影響

HSP27 的過(guò)表達(dá)顯著減少了由于H2O2刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生的 ROS（P＜0.01）。

2.4.3 過(guò)表達(dá)HSP27 對(duì)牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞G6PD、GSH-Px 活性的影響

由表4 可知，對(duì)HSP27 的過(guò)表達(dá)顯著增強(qiáng)了由于 H2O2刺激而降低的 G6PD 活性（P＜0.01），GSH-Px活性的活性變化呈現(xiàn)與G6PD 相似的結(jié)果（P＜0.01）。

圖2 過(guò)表達(dá)HSP27 對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞HSP27 表達(dá)的影響Fig.2 Effect of overexpression of HSP27 on HSP27 abundance in UCE

圖3 過(guò)表達(dá)HSP27 對(duì)牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞ROS 含量的影響Fig.3 Effect of overexpression of HSP27 on the content of ROS in UCE

表4 過(guò)表達(dá)HSP27 對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞G6PD 及GSH-Px 活性的影響Table 4 Effect of overexpression of HSP27 on the activity of SOD and GSH-Px in UCE

2.4.4 過(guò)表達(dá)和沉默HSP27 對(duì)牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞GSH 和 GSSG 的含量檢測(cè)

由表5 可知，對(duì)HSP27 的過(guò)表達(dá)顯著降低了細(xì)胞中由于 H2O2刺激而增加的 GSSG 含量（P＜0.01），GSH活性的含量變化呈現(xiàn)于GSSG 相反的結(jié)果（P＜0.01）。

表5 過(guò)表達(dá)HSP27 對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞GSSG 及GSH 含量的影響Table 5 Effect of overexpression of HSP27 on the content of GSSG and GSH in UCE

3 討論

奶牛胎衣不下本身是一種多因素疾病，目前的研究涉及了更為微觀的層次，例如胎盤(pán)在分離以及排出過(guò)程中一些分子的變化，大致概括為免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)，細(xì)胞外基質(zhì)的重塑以及細(xì)胞凋亡等。而實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證并研究了在RFM 奶牛及子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中HSP27 對(duì)其氧化應(yīng)激的影響，從HSP27 通過(guò)調(diào)節(jié)G6PD 進(jìn)而影響GSH 的合成的途徑對(duì)氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)從而探討其對(duì)奶牛分娩后胎衣排出的影響。

HSP27 在生物體內(nèi)發(fā)揮作用主要通過(guò)磷酸化和特異的寡聚化兩種途徑；研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)生物體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)[17]，HSP27 迅速形成較大分子的寡聚化結(jié)構(gòu)（＞400 kDa），過(guò)一段時(shí)間后HSP27 會(huì)逐漸轉(zhuǎn)化為較小的寡聚化結(jié)構(gòu)（＜200 kDa），而寡聚化的HSP27 主要發(fā)揮其“分子伴侶”的功能[18]，在細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，修復(fù)發(fā)生錯(cuò)誤折疊的蛋白，將其維持在折疊狀態(tài)，并且可以使受損不嚴(yán)重的多肽鏈重新折疊；保護(hù)細(xì)胞骨架以及降低DNA 損傷[19]。而細(xì)胞處于氧化應(yīng)激時(shí)，大分子量寡聚化的HSP27 甚至可能會(huì)增加ATP 依賴(lài)性伴侶分子（Hsp70）的效率，而實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)奶牛發(fā)生胎衣不下時(shí)，HSP27 的表達(dá)量上升，但是大部分以磷酸化形式存在；其寡聚化分子量顯著降低，所以HSP27 可能通過(guò)上述功能在一定程度上影響胎衣的排出。

之前的研究發(fā)現(xiàn)寡聚化的可以刺激6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PD）的活性[20]，而 G6PD 是戊糖磷酸途徑的第一個(gè)酶，在細(xì)胞中催化能量代謝，該酶也是限速酶，而這一途徑是紅細(xì)胞中還原型輔酶Ⅱ（NADPH）的唯一來(lái)源，而實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HSP27 寡聚化的減少，降低了G6PD 的活性，可能導(dǎo)致了NADPH 的減少，使得紅細(xì)胞中H2O2的堆積，最終導(dǎo)致氧自由基的產(chǎn)生，破壞紅細(xì)胞，導(dǎo)致胎盤(pán)局部缺氧壞死，使得胎盤(pán)無(wú)法正常分離；而其G6PD 不僅僅參與戊糖磷酸途徑，也參與糖酵解途徑，兩種途徑中都產(chǎn)生ATP，由于HSP27 降低了其活性，導(dǎo)致ATP 產(chǎn)生減少，使得奶牛在分娩時(shí)由于子宮收縮無(wú)力易發(fā)生難產(chǎn)[21]，而在產(chǎn)后更難以正常排出胎衣，故而極大的增加了RFM 的發(fā)生概率。

戊糖磷酸途徑的生物學(xué)功能遠(yuǎn)不止于此[22]，在該途徑中生成的NADPH 會(huì)與氧化型谷胱甘肽（Glutathione Disulfide，GSSG）經(jīng)由谷胱甘肽還原酶（Glutathione Reductase，GS）生成還原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH），GSH 是一種含半胱氨酸的三肽（γ-Glu-Cys-Gly），在真核細(xì)胞中廣為存在，濃度大約在0.5～10 mM，而當(dāng)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，硒依賴(lài)性谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）通過(guò)利用GSH 還原有機(jī)過(guò)氧化物以及H2O2，維持細(xì)胞正常的氧化水平，而GSH 則被氧化變?yōu)镚SSG，GSH 的還原能力足以對(duì)細(xì)胞的氧化損傷提供一定的保護(hù)作用；而研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)奶牛發(fā)生RFM 時(shí)，GSH-Px 的活性出現(xiàn)顯著性的變化，實(shí)驗(yàn)中降低的HSP27 寡聚化蛋白使得其未能發(fā)揮“分子伴侶”的功能，可能導(dǎo)致了幾種酶活性的變化；由于G6PD 活性的降低，使得能量及NADPH 生成減少，最終導(dǎo)致GSH 生成不足，而使得奶牛處于嚴(yán)重的氧化應(yīng)激狀態(tài)下，極大的增加胎衣無(wú)法正常排出可能性。

而當(dāng)機(jī)體處于氧化狀態(tài)時(shí)，還易生成不飽和脂肪酸-亞油酸（Linolic acid）和花生四烯酸（ARA），它們是部分重要激素，如前列腺素合成的前體；GSHPx 還通過(guò)催化前列腺素G2（PGG2）向前列腺素H2（PGH2）轉(zhuǎn)化進(jìn)而直接參與花生四烯酸的代謝[23]。而機(jī)體大量的ROS 可能導(dǎo)致PGG / H 合酶不可逆的失活，并且由于細(xì)胞調(diào)用了大量的GSH-Px 減少ROS的產(chǎn)生[24]，從而可能影響前列腺素的濃度，已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)前列腺素濃度的失常易導(dǎo)致RFM。

綜上所述，HSP27 對(duì)于氧化應(yīng)激狀態(tài)下奶牛胎衣的排出與分離是一個(gè)多過(guò)程的影響：首先，HSP27本身對(duì)于氧化應(yīng)激狀態(tài)具有一定的調(diào)節(jié)功能，其次HSP27 在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，對(duì)G6PD 以及GS 活性的調(diào)節(jié)，進(jìn)而影響GSH 的生成，而這一過(guò)程中的酶以及最終產(chǎn)物GSH 都能對(duì)ROS 發(fā)揮一定的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而協(xié)同影響胎衣的排出。