王進鵬， 龍啟福， 雷延成， 張 豪， 林存山△

（1青海省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，2青海大學醫(yī)學院基礎醫(yī)學研究中心，青海西寧810007）

腦血管疾病是嚴重危害人類健康的一類疾病，致死率和致殘率都很高，腦微血管內(nèi)皮細胞不僅是組織與血液之間的屏障，而且還具有多種分泌功能，因此，微血管內(nèi)皮細胞的損傷與腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關系［1-2］。研究報道微小RNA-149-5p（microRNA-149-5p，miR-149-5p）在短暫性大腦中動脈栓塞模型大鼠和氧糖剝奪/復氧模型處理后的細胞中顯著下降，miR-149-5p 通過靶向S1PR2 減輕大鼠急性腦缺血再灌注后血腦屏障的通透性［3］。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）MIAT通過miR-149-5p 靶向調(diào)控CD47 導致巨噬細胞胞葬障礙，從而促進動脈粥樣硬化斑塊的進展和不穩(wěn)定［4］。以上研究表明miR-149-5p 影響腦血管相關疾病的發(fā)生，且受到lncRNA 的調(diào)控。另有研究表明，lncRNA 在動脈粥樣硬化、卒中、動脈瘤等血管相關疾病中也發(fā)揮重要作用［5］。我們通過在線軟件預測到miR-149-5p 與lncRNA LINC00339 有結合位點。有研究報道，LINC00339 高表達通過調(diào)節(jié)miR-22-3p/NLRP3 信號通路促進草酸鈣誘導的腎小管上皮細胞凋亡［6］。LINC00339 在阿霉素誘導的心肌細胞凋亡中高表達，敲除LINC00339通過miR-484可提高心肌細胞活力并減少細胞凋亡［7］。以上研究表明LINC00339 可影響細胞凋亡過程。然而LINC00339對人腦微血管內(nèi)皮細胞（human brain microvascular endothelial cells，HBMEC）凋亡和氧化應激反應的影響及機制尚不清楚。因此，本研究通過用氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）誘導HBMEC 凋亡和氧化應激反應，探討LINC00339對ox-LDL 誘導的HBMEC 凋亡和氧化應激反應的影響及其機制是否與miR-149-5p有關。

材料和方法

1 材料

HBMEC 及內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基購自Sciencell；胎牛血清購自Gibco；ox-LDL 購自上海經(jīng)科化學科技有限公司；Trizol 試劑、反轉錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa；丙二醛（malonaldehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒和雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；RIPA蛋白裂解液和BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物科技有限公司。

2 方法

2.1 細胞處理與分組 HBMEC 用含10%胎牛血清的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期HBMEC，用50 mg/L ox-LDL 處理，記為ox-LDL 組；對照（control）組僅加入等量培養(yǎng)基進行常規(guī)培養(yǎng)；將LINC00339 的抑制表達載體（si-LINC00339）及其陰性對照（si-NC），以及miR-149-5p模擬物及其陰性對照（miR-NC）分別轉染至HBMEC后用50 mg/L ox-LDL 處理，分別記為ox-LDL+si-NC組、ox-LDL+si-LINC00339 組、ox-LDL+miR-NC 組 和ox-LDL+miR-149-5p 組；將si-LINC00339 分別與miR-149-5p 的抑制表達載體（anti-miR-149-5p）及其陰性對照（anti-miR-NC）共轉染至HBMEC 后用50 mg/L ox-LDL 處 理，記 為ox-LDL+si-LINC00339+anti-miRNC組和ox-LDL+si-LINC00339+anti-miR-149-5p組。

2.2 RT-qPCR 檢 測LINC00339 和miR-149-5p 的 表達水平 各組細胞培養(yǎng)48 h，提取總RNA，反轉錄成cDNA，按照試劑盒使用說明進行PCR，反應條件為：95℃5 min；95℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，共40 個循環(huán)；60℃延長5 min。相對表達量用2-ΔΔCt法計算。LINC00339 和miR-149-5p 分 別 以GAPDH 和U6 為 內(nèi)參照。LINC00339 的上游引物序列為5'-GGTTGAC?GAAGTCTGGAACG-3'，下 游 引 物 序 列 為 5'-GCCCATCATTTCATTGGGTA-3'；GAPDH 的上游引物序列為5'-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3'，下游引物序列為5'-CCATGTAGTTGAGGTCAATGAAG-3'； miR-149-5p 的 上 游 引 物 序 列 為 5'-GTCTTCACTCCCGTGCTTGT-3'，下游引物序列為5'-CCCGAAACACCCGTAAGATA-3'；U6 的上游引物序列為5'-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3'，下游引物序列為5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3'。引物由上海生工生物工程公司合成。

2.3 MDA 含量及SOD 和CAT 活性的檢測 細胞培養(yǎng)48 h 后收集各組細胞，按用MDA、SOD 和CAT 檢測試劑盒說明書進行操作。

2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 各組細胞培養(yǎng)48 h，用預冷的PBS 漂洗2 次，加入10 μL 的annexin VFITC，再加入5 μL 的PI，混勻后避光孵育10 min；用流式細胞術檢測細胞凋亡率。

2.5 Western blot 法檢測Bcl-2 和Bax 蛋白表達 提取總蛋白并用BCA 法進行定量，然后取50 μL 蛋白樣品進行SDS-PAGE，電泳結束后經(jīng)過電轉將蛋白樣品轉移到PVDF 膜上，轉膜結束后用用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，封閉結束后倒掉封閉液，將膜用TBST清洗后加入Ⅰ抗（1∶800）4℃孵育過夜，然后倒掉Ⅰ抗，再用TBST 洗膜，洗滌3 次后加入HRP 標記的Ⅱ抗（1∶1 000），室溫搖床孵育2 h，TBST洗膜，洗滌3次后加入ECL 顯色液進行顯色，接著在暗室下通過X線對膠片進行顯影、定影。最后用Quantity One 軟件分析蛋白條帶灰度值。蛋白的相對表達量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參照GAPDH灰度值。

2.6 雙螢光素酶報告基因實驗檢測LINC00339 對miR-149-5p 的靶向調(diào)控 使用PCR 擴增包含miR-149-5p 結合位點的LINC00339 序列片段，并構建至螢光素酶表達載體中，獲得LINC00339 野生型載體（WT-LINC00339）；將LINC00339 部分序列（GCC?GAGGAGCCAGA）突變?yōu)閁CAGAUCCAUACG，獲得LINC00339 突變型載體（MUT-LINC00339）；將WTLINC00339 和MUT-LINC00339 分 別 與miR-NC 和miR-149-5p 用Lipofectamine 2000 共轉染至HBMEC中；轉染48 h后，根據(jù)雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒說明檢測螢光素酶活性。將si-NC、si-LINC00339、pcDNA 和pcDNA-LINC00339 轉 染至HBMEC 中，按2.2中的方法檢測miR-149-5p表達水平。

3 統(tǒng)計學處理

用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。兩組間均數(shù)比較行t 檢驗；多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q 檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 LINC00339 和miR-149-5p 在ox-LDL 誘 導 的HBMEC中的表達

RT-qPCR 結果顯示，與對照組相比，用50 mg/L ox-LDL 處理的HBMEC 中LINC00339 的表達水平顯著升高，miR-149-5p的表達水平顯著降低（P＜0.05），見表1。以上結果表明，ox-LDL 可提高HBMEC 中LINC00339的表達，降低miR-149-5p的表達。

表1 LINC00339 和miR-149-5p 在ox-LDL 誘 導的HBMEC中的表達Table 1. The expression of LINC00339 and miR-149-5p in HBMEC induced by ox-LDL（Mean±SD. n=9）

2 抑制LINC00339表達對ox-LDL誘導的HBMEC氧化應激的影響

HBMEC 經(jīng)ox-LDL 誘導后LINC00339 的表達水平升高，MDA 的含量升高，SOD 和CAT 的活性降低（P＜0.05）；然而轉染si-LINC00339 后再經(jīng)ox-LDL 處理，HBMEC 中LINC00339的表達水平降低，MDA 含量降低，SOD 和CAT 活性升高（P＜0.05），見表2。以上結果表明，ox-LDL 可誘導HBMEC 氧化應激的產(chǎn)生，而抑制LINC00339 表達可減弱ox-LDL 誘導的HBMEC氧化應激。

表2 抑制LINC00339表達對ox-LDL誘導的HBMEC氧化應激的影響Table 2. The effect of LINC00339 expression inhibition on ox-LDL-induced oxidative stress in HBMEC（Mean±SD. n=9）

3 抑制LINC00339表達對ox-LDL誘導的HBMEC凋亡的影響

流式細胞術結果顯示，ox-LDL 誘導的HBMEC凋亡率升高，Western blot 檢測結果顯示，ox-LDL 誘導的HBMEC 中凋亡相關蛋白Bcl-2 的表達水平降低，Bax 的表達水平升高（P＜0.05）；而轉染si-LINC00339后再經(jīng)ox-LDL處理，HBMEC的凋亡率降低，Bcl-2 表達水平升高，Bax 表達水平降低（P＜0.05），見圖1 及表3。以上結果表明，ox-LDL 可誘導HBMEC 凋亡，而抑制LINC00339 表達可降低ox-LDL誘導的HBMEC凋亡率。

Figure 1. The effect of LINC00339 expression inhibition on ox-LDL-induced apoptosis of HBMEC. A：the images of Western blot for determining the protein expression of apoptosis-related molecules；B：the images of flow cytometry for analyzing the apopto?sis of HBMEC.圖1 抑制LINC00339表達對ox-LDL誘導的HBMEC凋亡的影響

表3 抑制LINC00339表達對ox-LDL誘導的HBMEC凋亡的影響Table 3. The effect of LINC00339 expression inhibition on ox-LDL-induced apoptosis of HBMEC（Mean±SD. n=9）

4 LINC00339靶向調(diào)控miR-149-5p的表達

LncBase Predicted v2 在線軟件預測結果顯示，LINC00339 的序列中含有與miR-149-5p 互補的核苷酸序列，見圖2A。 將miR-149-5p 分別與WTLINC00339 和MUT-LINC00339 共轉染至HBMEC 中，再檢測轉染后細胞的螢光素酶活性，結果顯示，miR-149-5p 與WT-LINC00339 共轉染的細胞螢光素酶 活 性 降 低（P＜0.05），而miR-149-5p 與MUTLINC00339 共轉染的細胞螢光素酶活性無顯著變化（P＞0.05），見 圖2B。RT-qPCR 結 果 顯 示，轉 染LINC00339 的過表達載體后miR-149-5p 的表達水平降低；而轉染LINC00339 的抑制表達載體后miR-149-5p 表達水平升高（P＜0.05），見圖2C。以上結果表明LINC00339可靶向負調(diào)控miR-149-5p的表達。

5 miR-149-5p 過表達對ox-LDL 誘導的HBMEC氧化損傷的影響

轉染miR-149-5p 模擬物后再用ox-LDL 處理細胞，結果顯示miR-149-5p 的表達水平升高，MDA 含量降低，SOD和CAT活性升高；流式細胞術檢測結果顯示，細胞凋亡率降低；Western blot檢測結果顯示，Bcl-2表達水平升高，Bax表達水平降低（P＜0.05），見圖3 及表4。以上結果表明，過表達miR-149-5p 可抑制ox-LDL誘導的HBMEC發(fā)生氧化應激和凋亡。

6 敲減miR-149-5p 表達逆轉了抑制LINC00339 表達對ox-LDL誘導的HBMEC氧化損傷的作用

將LINC00339 抑制表達載體和miR-149-5p 抑制表達載體共轉染至HBMEC 后用ox-LDL 處理，結果顯示，MDA 含量升高，SOD 和CAT 活性降低；流式細胞術檢測結果顯示，細胞凋亡率升高；Western blot檢測結果顯示，Bcl-2表達水平降低，Bax 表達水平升高（P＜0.05），見圖4 及表5。以上結果表明，抑制miR-149-5p 表達可逆轉抑制LINC00339 表達對ox-LDL誘導的HBMEC氧化應激和凋亡的影響。

Figure 2. LINC00339 targeted miR-149-5p and regulated the expression of miR-149-5p. A：LINC00339 contained a nucleotide se?quence complementary to miR-149-5p；B：dual-luciferase reporter experiment；C：LINC00339 regulated the expression of miR-149-5p. Mean±SD. n=9. *P＜0.05 vs miR-NC group；#P＜0.05 vs pcDNA group；&P＜0.05 vs si-NC group.圖2 LINC00339靶向調(diào)控miR-149-5p的表達

Figure 3. The effect of miR-149-5p over-expression on ox-LDL-induced apoptosis of HBMEC. A：the images of Western blot for de?termining the protein expression of apoptosis-related molecules；B：the images of flow cytometry for analyzing the apoptosis of HBMEC.圖3 miR-149-5p過表達對ox-LDL誘導的HBMEC凋亡的影響

表4 miR-149-5p過表達對ox-LDL誘導的HBMEC氧化損傷的影響Table 4. The effect of miR-149-5p over-expression on ox-LDL-induced oxidative damage of HBMEC（Mean±SD. n=9）

討 論

Figure 4. Knock-down of miR-149-5p expression reversed the effect of LINC00339 expression inhibition on ox-LDL-induced apopto?sis of HBMEC. A：the images of Western blot for determining the protein expression of apoptosis-related molecules；B：the images of flow cytometry for analyzing the apoptosis of HBMEC.圖4 敲減miR-149-5p表達逆轉了抑制LINC00339表達對ox-LDL誘導的HBMEC凋亡的作用

表5 敲減miR-149-5p表達逆轉了抑制LINC00339表達對ox-LDL誘導的HBMEC氧化損傷的作用Table 5. Knock-down of miR-149-5p expression reversed the effect of LINC00339 expression inhibition on ox-LDL-induced oxidative damage of HBMEC（Mean±SD. n=9）

腦微血管內(nèi)皮細胞作為構成血腦屏障的主要結構基礎，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的血管內(nèi)外物質交換中發(fā)揮著重要的作用，與腦缺血、腦水腫等腦血管疾病的病理過程密切相關［8］。ox-LDL 是引起血管內(nèi)皮細胞損傷的重要因素，常用于誘導細胞損傷，建立細胞損傷模型［9］。因此，本實驗通過用ox-LDL 誘導HB?MEC 建立細胞氧化損傷模型，結果顯示，ox-LDL 誘導的HBMEC凋亡增多，MDA含量升高，SOD和CAT活性降低。研究表明MDA 是脂質過氧化反應的終產(chǎn)物，可間接反映細胞氧化損傷程度；SOD 和CAT是細胞內(nèi)清除氧自由基的抗氧化酶，可保護細胞免受損傷［10］。因此，以上結果表明，ox-LDL 誘導的HBMEC氧化損傷模型建立成功。

miRNA 幾乎參與所有生命活動和多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程，在缺血性腦卒中亦發(fā)揮著重要作用，研究其機制可為缺血性腦卒中的診斷、治療及預后提供新的策略［11］。研究報道m(xù)iR-149-5p在缺血再灌注腦損傷中低表達，miR-149-5p 表達上調(diào)后減輕了腦缺血再灌注的損傷［12］。過表達miR-149-5p可抑制高糖誘導的胰島β 細胞凋亡，并減弱活性氧的產(chǎn)生［13］。miR-149-5p減輕了ox-LDL引起的人血管內(nèi)皮細胞內(nèi)皮損傷［14］。以上結果表明miR-149-5p可能具有減弱細胞氧化應激及細胞損傷的作用。本實驗結果顯示，ox-LDL 誘 導的HBMEC 中miR-149-5p 表 達水平降低；為研究miR-149-5p 對ox-LDL 誘導的HBMEC凋亡和氧化應激的影響，本實驗在轉染miR-149-5p的過表達載體后用ox-LDL 處理HBMEC 凋亡，結果顯示MDA 含量降低，SOD 和CAT 活性升高，細胞凋亡率降低，Bcl-2 表達水平升高，Bax 表達水平降低。這表明miR-149-5p 過表達可抑制ox-LDL 誘導的HBMEC凋亡和氧化應激反應。

為進一步研究miR-149-5p 對HBMEC 凋亡和氧化應激影響的可能機制，本實驗通過在線軟件預測了與miR-149-5p 可能結合的lncRNA，結果發(fā)現(xiàn)LINC00339 與miR-149-5p 具有結合位點，且本實驗還證實LINC00339 可靶向調(diào)控miR-149-5p 的表達。本實驗檢測了ox-LDL 誘導的HBMEC 中LINC00339的表達，結果發(fā)現(xiàn)LINC00339 表達水平升高；本實驗進一步抑制LINC00339 表達，結果顯示ox-LDL 誘導的HBMEC中MDA含量降低，SOD和CAT活性升高，細胞凋亡率降低，Bcl-2 表達水平升高，Bax 表達水平降低。這表明抑制LINC00339 表達可抑制ox-LDL誘導的HBMEC 凋亡和氧化應激反應。此外，本實驗同時抑制miR-149-5p 和LINC00339 表達后，ox-LDL誘導的HBMEC 中MDA 含量升高，SOD 和CAT 活性降低，細胞凋亡率升高，Bcl-2 表達水平降低，Bax 表達水平升高。這表明抑制miR-149-5p表達可逆轉抑制LINC00339 表達對ox-LDL 誘導的HBMEC 氧化損傷的作用。

綜上所述，抑制LINC00339 表達可能通過上調(diào)miR-149-5p 表達抑制ox-LDL 誘導的HBMEC 凋亡和氧化應激反應，對HBMEC損傷具有一定保護作用。