沈敏娟， 衛(wèi)敏佳， 何佳穎， 牛麗娜， 焦 凱△

（1軍事口腔醫(yī)學國家重點實驗室，口腔疾病國家臨床醫(yī)學研究中心，陜西省口腔疾病國際聯(lián)合研究中心，空軍軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院黏膜病科，陜西西安710032；2阜陽師范大學教育系，安徽阜陽236037）

乳腺癌是女性發(fā)病率最高的癌癥，在過去的十年中，全球發(fā)病率持續(xù)上升，死亡率高居不下。最新的統(tǒng)計學研究表明，僅2018 年，全球范圍內檢測出約210萬乳腺癌病例，其中近63萬患者死亡，因而也是女性死亡率最高的癌癥［1］。然而，許多癌癥患者的死亡并非由于腫瘤在原發(fā)部位生長，而是在于腫瘤侵襲或轉移至其他部位，其中乳腺癌最容易發(fā)生骨轉移［2］。在臨床上，骨轉移常給患者帶來極大的痛苦，嚴重影響患者生活質量。同時，腫瘤一旦轉移至骨組織，通常則無法治愈，總體預后差［3］。因此，乳腺癌的早期篩查尤為重要，而乳腺微鈣化（micro?calcification）是診斷早期乳腺癌的重要特征，也可能是早期乳腺惡性腫瘤的唯一指征［4］。但是，乳腺微鈣化作為一種病理性礦化（pathological mineraliza?tion）對乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及造成乳腺癌骨轉移的機制仍未明確。

因此，本文基于乳腺微鈣化和乳腺癌骨轉移這兩大特征，將分別從乳腺微鈣化的形成、微鈣化與骨轉移的聯(lián)系及早期診斷與治療這3 個方面分別進行闡述，以期充分理解微鈣化與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及相關骨轉移機制，為乳腺癌的診斷和個體化、精準化治療策略提供理論支撐。

1 乳腺微鈣化的分類

病理性礦化是指在軟組織中出現(xiàn)異位鈣化或礦化，繼而發(fā)生一系列嚴重影響患者健康的疾病，如骨關節(jié)炎、腎結石及乳腺癌等［5］。乳腺病理性微鈣化是指礦物在乳腺中發(fā)生異位沉積，且與乳腺癌的發(fā)生相關［6］。近年來，病理性礦化相關疾病的研究集中于礦物特性研究，如礦物的物理化學特征、結晶度、礦物類型等［7］。在乳腺相關病理性礦化疾病領域，礦物上述特征與乳腺癌關系的研究受到廣泛關注［8］

乳腺微鈣化根據(jù)礦物特征主要可分為兩類。Ⅰ型微鈣化是指由草酸鈣（calcium oxalate，CO；CaC2O4·2H2O）組成的異位礦化，通常晶體呈琥珀色，半透光，形似金字塔，表面較為平整；Ⅱ型微鈣化是指由磷酸鈣組成的異位礦化，主要為羥基磷灰石［hydroxyapatite，HAp；Ca10（PO4）6（OH）2］晶體，通常呈灰白色，不透明，卵形或梭形，表面不規(guī)則［9］。此外，最新的研究證實，乳腺微鈣化還存在第3 種礦物形式，即鎂取代型HAp（MgHAp）［10］。

乳腺微鈣化的類型可用于區(qū)分乳腺良惡性病損。O'Grady 等［4］發(fā)現(xiàn)，在55 名患者的活檢樣本中，CO 樣本的檢查結果均為良性；而活檢樣本中若存在HAp，結果均證實為惡性。同時，F(xiàn)rappart等［11］證實，Ⅱ型微鈣化存在于所有乳腺癌病變中，包括浸潤性癌、原位癌及導管癌；而Ⅰ型微鈣化僅存在于良性腫瘤內。此外，第3 種礦物形式即MgHAp，亦僅存在于惡性腫瘤中［4］。

因此，乳腺病理性微鈣化與乳腺良惡性腫瘤關系密切，探索微鈣化的形成原因可有助于理解乳腺良惡性病損的發(fā)生及發(fā)展。

2 乳腺微鈣化的形成機制

以往的觀點認為，乳腺癌易發(fā)生病理性鈣化的原因在于腫瘤細胞易發(fā)生退行性變。在高缺血缺氧環(huán)境下，大量腫瘤細胞壞死凋亡，礦物發(fā)生堆積，因此形成微鈣化［6］。而最近的研究證實，乳腺癌的病理性礦化實則是腫瘤細胞積極介導的過程［12］。Cox等［12］首次提出，HAp 晶體首先在乳腺癌細胞內形成，隨后被釋放至細胞外基質（extracellular matrix，ECM）中，晶體沉積并形成微鈣化。同時，最新研究表明，乳腺癌細胞會產生微鈣化的原因在于正常的乳腺細胞轉變?yōu)槿橄俪晒菢蛹毎╞reast osteoblastlike cells，BOLCs）［10］。Scimeca 等［13］發(fā)現(xiàn)，BOLCs 胞質中可出現(xiàn)HAp 晶體，繼而BOLCs 可通過細胞內囊泡的形式將礦物轉運至ECM。而在生理性礦化過程中，囊泡在介導礦物轉運及膠原礦化中同樣起到了重要的作用［14］。因此，上述研究均表明，乳腺癌的病理性礦化與生理性礦化過程中礦物在硬組織中的沉積極其相似。同時，病理性微鈣化的形成過程也是HAp沉積過程，因此，腫瘤細胞可調控HAp礦物原料——無機鈣及磷酸鹽的轉運及積累，進而發(fā)生微鈣化［12］。

鈣離子轉運相關蛋白annexins 家族與乳腺癌細胞內鈣離子的轉運相關。有研究表明，在乳腺腫瘤細胞內，annexin Ⅵ可作為腫瘤促進因子，而annexinⅠ與annexin Ⅱ可促進腫瘤細胞的侵襲［15］。同時，若乳腺細胞annexin Ⅵ缺失，則該類細胞的鈣離子轉運功能出現(xiàn)障礙，不能發(fā)生HAp 沉積［16］。此外，Zhang等［17］分析了與鈣穩(wěn)態(tài)調節(jié)密切相關的雷諾丁受體3（ryanodine receptor 3，RYR3）基因中miR-367 的結合位點，并證實A→G 的SNP 結合位點可促進乳腺細胞的鈣化。

Cox 等［18］發(fā)現(xiàn)，微鈣化的形成與堿性磷酸酶（al?kaline phosphatase，ALP）活性相關。ALP 可將焦磷酸鹽（pyrophosphate，PPi）水解成無機磷酸鹽（phos?phate，Pi），Pi 水平升高可促進微鈣化的形成［19］。同時，有研究表明，腫瘤細胞的增殖活動較強，需要消耗大量的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），而ATP 水解后可產生大量的Pi，因此造成腫瘤微環(huán)境Pi濃度升高，促使HAp形成［20］。

腫瘤微環(huán)境在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。細胞可通過與ECM 的相互作用影響腫瘤細胞的生長及侵襲，而膠原是構成乳腺ECM 最主要的成分，與乳腺微鈣化形成同樣相關。Cox 等［21］證實，乳腺癌細胞可在體外3D 膠原支架上生長增殖及發(fā)生微鈣化。也有研究證實，在乳腺組織活檢后植入的生物可降解膠原塞易引起植入位點乳腺微鈣化［22］。

在生理性礦化中，鈣磷礦物、膠原纖維及非膠原蛋白（non-collagenous proteins，NCPs）是骨組織發(fā)生礦化的基礎。而乳腺癌病理性微鈣化的發(fā)生除了與上述鈣磷礦物及膠原相關，NCPs同樣發(fā)揮了重要的作用［13］。骨橋蛋白（osteopontin，OPN）是一種磷酸化的NCPs，在骨組織中含量較為豐富。Timotheadou等［23］證實，乳腺癌微鈣化區(qū)常出現(xiàn)OPN 的高表達。此外，骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）相關mRNA在乳腺鈣化區(qū)的表達水平升高；骨粘連蛋白（osteo?nectin，OSN）及骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）的高表達同樣可促進乳腺癌的微鈣化與礦物沉積［9，24］。也有研究證實，以上NCPs 可能與乳腺癌的骨轉移關系密切［25］。

如前所述，乳腺病理性微鈣化的形成與生理性骨組織礦化相似，包括礦物形成過程及鈣磷轉運機制。膠原作為生理性礦物沉積的模板，通?？砂l(fā)生膠原纖維內外礦化。然而，乳腺癌微鈣化區(qū)是否存在膠原纖維的礦化及礦化膠原對乳腺癌細胞增殖及轉移的具體影響機制，仍需更多研究證實。此外，NCPs 在乳腺癌微鈣化區(qū)的過表達促進HAp 沉積的相關機制以及這種過表達是否會抑制HAp的成核繼而提高骨轉移的概率，則仍需進一步探究。

3 微鈣化與乳腺癌發(fā)展的關系

在乳腺微鈣化區(qū)，礦物若含有HAp 或MgHAp，通常認為是乳腺惡性腫瘤的信號［13］。究其原因可能在于，HAp 易與二價陽離子（如鎂離子）發(fā)生結合，造成微環(huán)境中鎂離子的耗竭繼而影響正常的DNA損傷修復過程及細胞的增殖和凋亡過程。因此，HAp 或MgHAp 具有致癌特性［10，26］。其次，有研究利用合成的HAp 晶體模擬Ⅱ型鈣化的腫瘤微環(huán)境，該研究證實乳腺癌細胞的有絲分裂增多［18］。Pathi等［27］發(fā)現(xiàn)，MDA-MB-231 及MCF-7 乳腺癌細胞在HAp 礦化支架中的增殖活動增強，遷移行為發(fā)生改變，溶骨因子IL-8 高表達。此外，HAp 還可引起乳腺細胞的炎性反應，從而使得環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）表達增加［28］。而COX-2 是乳腺腫瘤發(fā)展的重要促進因子，與腫瘤的大小和惡性分級相關。另有研究證實，COX-2 抑制劑阿司匹林的長期使用可有效降低乳腺癌發(fā)病率，而COX-2 過表達可促進腫瘤侵襲［29］。

雖然Ⅰ型微鈣化多與良性乳腺腫瘤相關，但最新的研究證實，Ⅰ型鈣化會向Ⅱ型鈣化發(fā)生轉變，繼而可表現(xiàn)為惡性腫瘤的特征［30］。Scimeca 等［13］發(fā)現(xiàn)，患者原乳腺病損處的良性CO 微鈣化，在多年后會伴有HAp 形成，同時這些病例均由良性轉為惡性程度高的低分化癌。他們通過共培養(yǎng)體系證實，乳腺癌細胞可由單核細胞介導成骨樣改變，即形成BOLCs。BOLCs 形成的主要原因在于，乳腺細胞可在轉化生長因子β（transforming growth factor β，TGFβ）作用下發(fā)生波形蛋白和連環(huán)蛋白易位，誘發(fā)上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）過程，使得乳腺細胞具備間充質細胞的特征［13］。隨后，這些細胞在成骨相關蛋白如BMP2 的作用下，轉變?yōu)锽OLCs，繼而發(fā)生礦物異位沉積［10］。

對微鈣化與乳腺癌發(fā)生分子機制的深入探索有助于我們進一步理解兩者的相關性。而目前，越來越多的研究證實，與微鈣化形成相關的BOLCs 及EMT 過程在乳腺癌的侵襲或骨轉移中也起到了重要作用［31］。

4 微鈣化與乳腺癌骨轉移的關系

在乳腺病變中，微鈣化的形成是BOLCs 活動及EMT 過程發(fā)生的信號，同時也可能是乳腺癌發(fā)生骨轉移的信號。Bonfiglio 等［32］通過5 年隨訪發(fā)現(xiàn)，微鈣化如MgHAp 可通過BOLCs 活動造成骨轉移。BOLCs 活動不僅能與成骨細胞產生親和力，而且可表達能夠調節(jié)骨穩(wěn)態(tài)的多種分子如核因子κB 受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）、Runt 相關轉錄因子2（Runt-related transcription factor 2，RUNX2）、維生素D 受體（vita?min D receptor，VDR）、OPN等［13，33］。

有研究表明，BOLCs 相關生物標志物（如RANKL 和RUNX2）的表達與乳腺癌骨轉移相關，如波形蛋白-RUNX2-RANKL呈陽性的患者更容易在診斷后的5 年內發(fā)生骨轉移［34］。由于乳腺細胞轉變?yōu)锽OLCs 經歷了EMT 過程，而EMT 現(xiàn)象使得腫瘤細胞獲得了在體循環(huán)中遷移的能力，成為循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumour cells，CTCs），這也是腫瘤細胞骨轉移的重要因素之一［35］。

有研究證實，微鈣化區(qū)常出現(xiàn)OPN 表達升高。OPN具有雙向促進作用，其既可以促進HAp形成，又可以促進乳腺癌細胞發(fā)生遠處骨轉移［30］。此外，Ⅱ型微鈣化可上調基質金屬蛋白酶（matrix metallopro?teinases，MMPs）的表達及活性，MMPs 是乳腺癌發(fā)展的多功能促進因子，可促進EMT 過程，增加RANKL表達，造成溶骨性骨轉移［36-37］。同時，乳腺癌微鈣化區(qū)可出現(xiàn)TGFβ 表達升高，而TGFβ 在乳腺癌骨轉移和侵襲中具有重要作用［13］。有研究表明，乳腺癌骨轉移瘤中TGFβ 信號較為活躍，而使用TGFβ 抑制劑或基因敲減技術則可以有效阻止腫瘤細胞的生長及遠處轉移［38］。

此外，在腫瘤微環(huán)境中含量豐富的膠原不僅可促進微鈣化的形成，同時也與乳腺癌骨轉移相關。有文獻表明，膠原作為保護性屏障可以抑制腫瘤細胞的侵襲，然而最近的研究證實保護性屏障較弱的膠原纖維反會促進腫瘤的轉移［39］。由于該種膠原的保護力較弱，從而造成大量惡性腫瘤細胞的堆積，繼而腫瘤細胞易于黏附于長條形的膠原纖維表面，膠原從而成為了腫瘤細胞發(fā)生遷移的“快速通道”并加快骨轉移過程［40］。

因此，微鈣化可能是乳腺癌骨轉移的信號（相關機制總結的示意圖見圖1）。

5 微鈣化診斷成像——早期識別高轉移潛力的乳腺癌

早期診斷及早期識別出具有高轉移潛力的乳腺癌對其治療及預后均具有重要意義。對乳腺微鈣化的物理化學特征進行分析，可有助于區(qū)分不同類型的乳腺病損。目前，通過臨床成像技術如乳腺X 射線技術，并不能可靠地區(qū)分Ⅰ型和Ⅱ型鈣化，因而不能診斷出具有高轉移潛力的乳腺癌（如微鈣化中若含有HAp 或MgHAp 可造成骨轉移）［4］。因此，乳腺活檢技術常運用于臨床以區(qū)分乳腺良惡性病損。但是，活檢技術具有一定創(chuàng)傷性，無論是穿刺活檢或是手術切除活檢，患者可能出現(xiàn)疼痛、血腫、局部感染等并發(fā)癥，甚至可能出現(xiàn)假陰性診斷結果［13］。因此，如何通過無創(chuàng)可視化檢測技術鑒別病理性鈣化分型，并將該技術轉化為臨床應用是當前研究的新興領域。

Figure 1. Breast microcalcification promotes breast cancer metastasis to bone. TGFβ：transforming growth factor β；EMT：epithelialmesenchymal transition；BMP：bone morphogenetic protein；HAp：hydroxyapatite；MgHAp：magnesium-substituted hy?droxyapatite.圖1 乳腺微鈣化促進乳腺癌骨轉移機制圖

有諸多研究表明，拉曼光譜作為一種散射光譜，可以區(qū)分Ⅰ型和Ⅱ型鈣化。雖然散射可造成光損失，限制了拉曼光譜運用的深度，但最新的技術表明，拉曼光譜可在40 毫米的深度進行組織內礦物分析［41］，因此可作為一種非侵入性的臨床成像技術來識別惡性腫瘤的微鈣化。最近的一項研究甚至利用拉曼光譜分析患者的血液樣本中HAp 含量的變化，以證實乳腺良惡性腫瘤［42］。另外，正電子發(fā)射體層成像技術（positron emission tomography，PET）是一種放射性同位素成像技術，也可用于檢測乳腺的異位鈣化［13］。Ahrens 等［43］在大鼠乳腺癌模型中利用熒光素標記的阿侖膦酸鹽（64Cu-DOTA-阿倫膦酸鈉）結合PET 技術來監(jiān)測和標記乳腺原位微鈣化。由于64Cu-DOTA-阿倫膦酸鈉對HAp 具有特異性結合的能力，因此是一種可用于鑒別微鈣化乳腺病變的新型PET示蹤劑，且具有測靈敏度高、特異性強等優(yōu)點。

用于鑒別乳腺病理性鈣化分型的可視化檢測技術有利于對具有高轉移潛力的乳腺癌進行早期診斷，該技術如今得到快速發(fā)展，如放射性示蹤劑的運用、新型X 射線成像技術等。這些技術運用于乳腺癌微鈣化檢測不僅可改善患者的就醫(yī)體驗及依從性，也可為醫(yī)生提供診斷、治療的新選擇。

對于具有高轉移潛力的乳腺癌的治療策略也可集中于分析BOLCs活動相關的分子?？笲OLCs生物標志物也可用于診斷和治療乳腺癌［13］。目前，抗RANKL 通路分子已經運用于對抗骨質疏松癥，后續(xù)也可成為乳腺癌的治療策略，如新型雙膦酸鹽可以用于抑制腫瘤轉移龕在骨組織中的定植和增殖等［44］。同時，有研究通過聯(lián)合用藥途徑——TGFβ 抑制劑聯(lián)合抑制腫瘤低氧環(huán)境，得到了較好的治療效果［45］。因此，采用最佳給藥方式，如聯(lián)合用藥相比于單獨用藥，也可以有效抑制腫瘤生長及骨轉移。

6 結語

乳腺微鈣化本質上是一種病理性的礦物沉積，也是一種異位鈣化。微鈣化中CO、HAp 及MgHAp的形成實則是腫瘤細胞積極調控的過程，與生理性硬組織礦化過程極相似。同時，微鈣化又可促進乳腺癌及乳腺癌骨轉移的發(fā)生。然而，微鈣化區(qū)是否會存在如同正常骨組織中膠原纖維的內外礦化、NCPs 在介導礦物沉積及對乳腺癌骨轉移的作用機制、微鈣化促進乳腺癌發(fā)生及轉移的具體分子機制依舊不明確。因此，仍需更多研究以完善關鍵調控因子作用、開發(fā)新型成像技術、建立臨床相關微鈣化-乳腺癌骨轉移模型，以更好地評估骨轉移的風險進而對易發(fā)生骨轉移的乳腺癌患者進行分類，從而為個性化、靶向性的精準治療方式提供指導，最終提高骨轉移患者的生存率及生存質量。