陸 英， 袁 青， 鄺麗華， 趙才翰， 張祥忠

（中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院 1輸血科，2血液科，廣東廣州510630）

血小板輸注用于預(yù)防和治療因血小板數(shù)量減少或者功能異常導(dǎo)致的出血，是臨床上挽救生命的重要治療手段之一。目前血小板普遍采用在血小板震蕩儀于室溫（20～24℃）中保存，保存期為3～7 d 不等，我國(guó)血小板的室溫保存期為5 d［1］。由于血小板的保存時(shí)間短，因此臨床上時(shí)常存在血小板供不應(yīng)求的情況。那么如何延長(zhǎng)血小板的保存期是大家長(zhǎng)期以來(lái)研究的科學(xué)問(wèn)題。4℃和冷凍保存法是研究比較多的2種方法［2-4］。

比較不同溫度儲(chǔ)存血小板功能的實(shí)驗(yàn)，比如體外灌注法研究血小板血栓的形成［5］，實(shí)時(shí)觀察血小板在體內(nèi)止血過(guò)程等［6］，通常需要先用熒光標(biāo)記物標(biāo)記好血小板，然后再在熒光顯微鏡下觀察并拍攝圖像，最終通過(guò)計(jì)算機(jī)分析圖像的熒光強(qiáng)度來(lái)比較不同溫度儲(chǔ)存下血小板功能的差異。由于熒光強(qiáng)度是分析結(jié)果的依據(jù)，因此必須保證實(shí)驗(yàn)所用的熒光標(biāo)記物對(duì)不同溫度下保存的血小板具有相似的標(biāo)記效果。本研究比較5-氯甲基熒光素二乙酸酯（5-chloromethylfluorescein diacetate，CMDFA）、碘代3，3'-二己氧基羰花青［3，3′-dihexyloxacarbocyanine io?dide，DiOC6（3）］及抗血小板膜糖蛋白（glycoprotein，GP）Ibβ抗體衍生物（anti-GPIbβ derivative）標(biāo)記不同溫度下儲(chǔ)存的血小板的效果，以期找出一種受溫度因素影響較小的血小板熒光標(biāo)記物。

材料和方法

1 試劑

Annexin V-Alexa Fluor 647 購(gòu)自Biolegend；兔抗小鼠CD62P抗體購(gòu)自BD；Cell TrackerTMCMFDA Dye購(gòu) 自Thermo Fisher Scientific；DiOC6（3）Dye 購(gòu) 自AAT Bioquest；抗GPIbβ抗體衍生物購(gòu)自Emfret。

2 血小板的獲取和保存

C57 小鼠購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。眼眶靜脈取血法獲取15 只C57 小鼠的全血，300 ×g 離心7 min，分離出上層的富血小板血漿，計(jì)數(shù)血小板，調(diào)整血小板濃度為1×1012/L。室溫組置于20～24℃的血小板震蕩儀保存，震蕩的速率為每分鐘60次。4℃組置于4℃冰箱（無(wú)震蕩）保存。冷凍組血小板加入6%的DMSO 置于-80℃冰箱保存。3 組血小板保存24 h后用于染色實(shí)驗(yàn)。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 血小板凋亡和活化率的檢測(cè) 冷凍組血小板在37℃水浴箱中解凍。室溫和4℃存儲(chǔ)的血小板及解凍后的血小板采用800×g 離心8 min，去上清，用PIPES 緩沖液重懸。分別從3 組中取適量血小板加入200 μL 的PIPES 液，使血小板的終濃度為1×109/L，加入Annexin V 或者抗CD62P 抗體，孵育20 min，置于流式細(xì)胞儀（BD，LSR FortessaX-20）上機(jī)檢測(cè)

3.2 CMFDA、DiOC6（3）及抗GPIbβ抗體衍生物對(duì)血小板染色效果的檢測(cè) PIPES 液重懸的每組血小板各分為3 等份，分別加入CMFDA、DiOC6（3）及抗GPIbβ 抗體衍生物染色，使終濃度分別為5 μmol/L、2 μmol/L 和2 μmol/L。染色30 min 后離心、洗滌，從各組血小板取適量用PIPES 液重懸，使血小板濃度為1×109/L，于流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)分析采用軟件SPSS 17.0 完成。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）進(jìn)行描述，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行多組間比較，并用Bonferron 法進(jìn)行多重比較。假設(shè)檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CMFDA和DiOC6（3）的對(duì)血小板的標(biāo)記效果

CMFDA 對(duì)室溫、4℃和冷凍血小板的標(biāo)記陽(yáng)性率 分 別 為（97.67±1.56）% 、（98.33±1.85）% 和（69.43±6.35）%，DiOC6（3）的陽(yáng)性率則分別為（98.67±1.53）%、（99.40±0.53）%和（83.63±10.01）%；室溫、4℃和冷凍血小板CMFDA 的平均熒光強(qiáng)度（mean flu?orescence intensity，MFI）分別為8 405±1 350、8 342±1 256 和1 398±167，DiOC6（3）的MFI 則 分 別 為45 346±3 766、43 999±3 229 和5 187±201，見(jiàn)圖1。與前兩組相比，冷凍血小板CMFDA 和DiOC6（3）染色的陽(yáng)性率及MFI 均顯著降低（P＜0.05），表明CMFDA和DiOC6（3）對(duì)冷凍血小板的標(biāo)記效果差于室溫組和4℃組。

2 室溫、4℃和冷凍血小板的凋亡以及活化率

室溫、4℃和冷凍組血小板凋亡率分別為（2.463±1.320）% 、（2.317±1.412）% 和（54.700±9.042）%，與前兩組相比，冷凍組血小板的凋亡率顯著增加（P＜0.01）；3 組血小板CD62P 的陽(yáng)性率分別為（8.158±3.582）%、（8.070±4.478）%和（31.950±12.380）%，冷凍組血小板CD62P 的陽(yáng)性率大于室溫和4℃組（P＜0.01）。3 組血小板CD62P 的MFI 則分別為298±10.75、294.3±14.64 和428.8±45.07，冷凍血小板CD62P 的MFI 明顯大于前兩者（P＜0.01），見(jiàn)圖2。上述結(jié)果表明，冷凍血小板的凋亡和活化率顯著高于室溫和4℃組。

Figure 1. Positive percentage and mean fluorescence intensity（MFI）of CMFDA and DiOC6（3）in the platelets preserved in room temperature（RT），4℃and frozen state. A：positive percentage of CMFDA；B：positive percentage of DiOC6（3）；C：MFI of CMFDA and DiOC6（3）. Mean±SD. n=3. *P＜0.05，**P＜0.01 vs frozen group.圖1 CMFDA和DiOC6（3）對(duì)室溫、4℃和冷凍血小板標(biāo)記的陽(yáng)性率和MFI的比較

3 抗GPIbβ抗體衍生物的標(biāo)記效果

抗GPIbβ 抗體衍生物對(duì)室溫、4℃和冷凍血小板標(biāo) 記 的 陽(yáng) 性 率 分 別 為（95.30±3.23）%、（95.30±3.28）%和（95.17±3.45）%；MFI 則分別為5 247±423、4 938±785和4 867±662，3組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），見(jiàn)圖3。上述結(jié)果表明，抗GPIbβ抗體衍生物對(duì)3組血小板的標(biāo)記效果相似。

討 論

22℃震蕩保存是目前臨床上普遍應(yīng)用的血小板保存方法，然而其保存期只有幾天。為延長(zhǎng)保存期，許多實(shí)驗(yàn)致力于4℃和冷凍血小板存儲(chǔ)的研究。血小板在儲(chǔ)存過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)血小板儲(chǔ)存損傷（platelet storage lesion，PSL），表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)改變、細(xì)胞表面抗原減少、細(xì)胞器功能受損、細(xì)胞內(nèi)代謝水平變化等［7-8］。不同儲(chǔ)存溫度下血小板的PSL 程度不一，凋亡和活化是血小板PSL 的重要表現(xiàn)，血小板內(nèi)部的一些細(xì)胞器例如線粒體、各種酶類的功能會(huì)隨著凋亡和活化程度的增加而降低。

在比較不同溫度保存的血小板的止血功能時(shí)，最好的途徑是能實(shí)時(shí)觀察血小板在體內(nèi)的止血過(guò)程。而臨床上往往只是通過(guò)觀察患者出血情況的變化來(lái)判斷止血功能的，很難實(shí)時(shí)觀察患者體內(nèi)的止血過(guò)程，因此目前研究血小板體內(nèi)止血的實(shí)驗(yàn)主要在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)施［6］，此研究需要有效的血小板的標(biāo)記方法。標(biāo)記血小板的最常用方法包括基因工程技術(shù)導(dǎo)入熒光基因以及熒光染料標(biāo)記血小板；后者又可以分為兩類：一是血小板特異性熒光染料，即帶有熒光染料的血小板抗體，另外一類是血小板非特異性染料，包括多種熒光素，它們能與多種細(xì)胞結(jié)合。熒光基因標(biāo)記法操作比較繁瑣，實(shí)驗(yàn)要求較高，而且有研究表明轉(zhuǎn)染熒光基因的動(dòng)物的血小板功能有不同程度的變化［9］。

Figure 2. Apoptosis and activation of platelets preserved in room temperature（RT），4℃and frozen state. A：positive percentage of Annexin V；B：positive percentage of CD62P；C：mean fluorescence intensity（MFI）of CD62P. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs frozen group.圖2 室溫、4℃和冷凍存儲(chǔ)下血小板凋亡和活化程度的比較

本研究試圖為室溫、4℃及冷凍存儲(chǔ)的血小板尋找出一種合適的熒光標(biāo)記物，此標(biāo)記物必須對(duì)3 種溫度保存的血小板標(biāo)記效果相似，因此，血小板特異性熒光染料應(yīng)該是針對(duì)基本不受溫度影響的血小板表面抗原，而血小板非特異性染料也應(yīng)該是針對(duì)受溫度影響很小的細(xì)胞器、蛋白基團(tuán)和酶類等等。本研究比較了CMDFA 和DiOC6（3）兩種血小板非特異性熒光染料和抗GPIbβ 抗體衍生物血小板特異性熒光染料的標(biāo)記效果。

CMDFA 含有能與硫醇反應(yīng)的氯甲基，在細(xì)胞內(nèi)通過(guò)酶的作用轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂袩晒獾奈镔|(zhì)，此產(chǎn)物能經(jīng)過(guò)細(xì)胞分裂傳遞給子細(xì)胞，但是不能轉(zhuǎn)移到相鄰細(xì)胞。CMFDA 染色細(xì)胞是目前常用的細(xì)胞評(píng)價(jià)方法，具有方便、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)點(diǎn)［10］。許多實(shí)驗(yàn)研究用CMFDA 標(biāo)記各種類型的細(xì)胞，例如果蠅精子、血小板、紅細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞的研究［11-12］。CMFDA 無(wú)細(xì)胞毒性，不影響細(xì)胞的活力和增殖［13］。DiOC6（3）是一種陽(yáng)離子親脂性熒光染料，可用于線粒體、細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和囊泡膜的熒光標(biāo)記，其信號(hào)可以通過(guò)熒光顯微鏡或流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)［14］。DiOC6（3）可應(yīng)用于多種細(xì)胞的熒光標(biāo)記，比如淋巴細(xì)胞、血小板和肺癌細(xì)胞，未見(jiàn)其相關(guān)細(xì)胞毒性的報(bào)道［15-16］。當(dāng)線粒體功能受損導(dǎo)致其線粒體膜電位降低時(shí)，細(xì)胞對(duì)DiOC6（3）的攝入就會(huì)減弱，表現(xiàn)為熒光強(qiáng)度降低［16］。抗GPIb 抗體衍生物是抗小鼠血小板/巨核細(xì)胞表面GPIb-V-IX 復(fù)合物上的亞單位——GPIbβ 的抗體衍生物。與一般抗GPIb 抗體相比，該抗體經(jīng)過(guò)修飾改良，能夠穩(wěn)定標(biāo)記體內(nèi)循環(huán)血小板，而且在推薦劑量范圍內(nèi)，抗GPIbβ 衍生物沒(méi)有毒性，不干擾體內(nèi)血小板黏附和聚集，用于分析體內(nèi)循環(huán)血小板的功能［6，17］。

Figure 3. Positive percentage and mean fluorescence intensity（MFI）of anti-GPIbβ derivative in platelets preserved in room tempera?ture（RT），4℃and frozen state. A：positive percentage of anti-GPIbβ derivative；B：MFI of anti-GPIbβ derivative.Mean±SD. n=3.圖3 抗GPIbβ抗體衍生物對(duì)室溫、4℃和冷凍血小板標(biāo)記的陽(yáng)性率和MFI的比較

本研究中，熒光染料標(biāo)記結(jié)果顯示CMFDA 和DiOC6（3）兩種染料對(duì)冷凍組血小板的標(biāo)記效果明顯差于室溫組和4℃組。CMFDA 本身無(wú)熒光，進(jìn)入細(xì)胞后可能通過(guò)一種叫谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的酶類的作用而轉(zhuǎn)變?yōu)橛袩晒獾奈镔|(zhì)，所以CMFDA 熒光的強(qiáng)度可以反映細(xì)胞的活力［12，18］。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明冷凍血小板的CD62P 以及Annexin V 陽(yáng)性率分別高達(dá)（31.95±12.38）%和（54.70±9.04）%，說(shuō)明血小板活化率以及凋亡率很高［19］，這種狀態(tài)下血小板的活力大大降低，因而，其對(duì)CMFDA 的著色能力也大大降低。這與Wang 等［10］的研究的相似，他們發(fā)現(xiàn)室溫儲(chǔ)存的血小板，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，血小板的凋亡以及活化率增加，CMFDA 的著色效果則逐漸降低。DiOC6（3）是主要用于線粒體染色的熒光染料，隨著凋亡程度的增加其熒光強(qiáng)度減弱，冷凍血小板的凋亡率很高，因此可表現(xiàn)為對(duì)DiOC6（3）的著色效果明顯低于液態(tài)保存的血小板。

血小板在活化的過(guò)程中可以出現(xiàn)多種蛋白的脫落，其中GPIbα 和GPVI 的脫落就是非常典型的例子［20］。Fong 等［21］從活化的血小板上清液中鑒定出1 048種蛋白，其中69種為帶有一個(gè)或者多個(gè)跨膜域或者一個(gè)糖基磷脂酰肌醇I 錨定的血小板膜蛋白。GPIbβ 是血小板糖蛋白GPIb 的組成亞基之一，2 個(gè)GPIbβ和1個(gè)GPIbα構(gòu)成了GPIb，有研究報(bào)道冷凍血小板表面的GPIbα 顯著減少［22］，這與冷凍血小板活化增加導(dǎo)致GPIbα 脫落有關(guān)。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，盡管冷凍組血小板的活化率增高，抗GPIbβ 抗體衍生物對(duì)室溫、4℃和冷凍組的染色效果相似，說(shuō)明溫度對(duì)血小板表面GPIbβ 的影響很小。因此，抗GPIbβ抗體衍生物可考慮作為熒光標(biāo)記物應(yīng)用于比較室溫、4℃和冷凍保存血小板功能的相關(guān)實(shí)驗(yàn)。