林 強(qiáng), 楊 超, 李美麗, 王 佳, 侯瀚然, 邵 兵, 牛宇敏*

(1.北京市延慶區(qū)疾病預(yù)防控制中心,北京 102100;2.北京市疾病預(yù)防控制中心,北京 100013)

貝類毒素亦稱為藻毒素,由浮游植物自然產(chǎn)生,按照化合物性質(zhì)主要分為脂溶性和水溶性兩大類[1]。脂溶性貝類毒素主要包括大田軟海綿酸毒素(OA)、鰭澡毒素(DTX)、扇貝類毒素(PTX)和原多甲藻毒素(AZAs)等毒素。相關(guān)研究表明,OA和DTX具有腹瀉毒性,PTX具有肝毒性,誤食脂溶性貝類毒素容易引起惡心、嘔吐、腹瀉等癥狀[2-5]。歐洲食品安全局(EFSA)對(duì)各類脂溶性貝類毒素及其亞型的食用安全計(jì)量、急性中毒劑量和限值都做了明確的規(guī)定[6,7],如AZAs、PTX2總最大殘留限量均為160.0 μg/kg,并根據(jù)新的毒理學(xué)數(shù)據(jù)將OA和DTXs的限量標(biāo)準(zhǔn)修訂為45 μg/kg。目前我國(guó)沒(méi)有相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)。脂溶性貝類毒素中毒事件近幾年在我國(guó)頻繁出現(xiàn),2010年9月～2019年5月,香港、澳門(mén)、珠海、寧波、福建、秦皇島、唐山等地陸續(xù)出現(xiàn)70余起貝類毒素中毒事件[8,9]。

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[10-14]報(bào)道,OA類毒素可長(zhǎng)期蓄積于腸道等組織內(nèi),經(jīng)組織吸收后主要以原型化合物的形式通過(guò)尿和糞便排出。針對(duì)生物樣品中毒素的篩查有利于快速準(zhǔn)確判斷中毒原因。目前,我國(guó)關(guān)于脂溶性貝類毒素的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)有GB 5009.212-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)貝類中腹瀉性貝類毒素的測(cè)定》,該方法僅規(guī)定了貝類樣品中OA、DTX1、DTX2等3種化合物的檢測(cè)方法。針對(duì)生物樣品中脂溶性貝類毒素的檢測(cè)方法[11-14]較少,現(xiàn)有檢測(cè)方法主要存在以下兩方面問(wèn)題:(1)生物樣品中脂溶性貝類毒素以O(shè)A、DTX1、DTX2等3種化合物為主,目標(biāo)化合物種類較少;(2)多采用固相萃取方法處理生物樣品,前處理過(guò)程復(fù)雜,靈敏度低。為進(jìn)一步完善突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)體系,亟須建立生物樣品中脂溶性貝類毒素的檢測(cè)方法,為食物中毒等突發(fā)公共衛(wèi)生事件的流行病學(xué)調(diào)查以及中毒者的臨床救治提供技術(shù)支持。

本方法以超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀為研究平臺(tái),建立了簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確檢測(cè)血漿、尿液中12種脂溶性貝類毒素的方法,可為食物中毒事件的處理提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

QTRAP 6500+超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)SCIEX公司);漩渦混合器(德國(guó)IKA公司);冷凍離心機(jī)(美國(guó)Eppdendorf公司);Milli-Q超純水器(美國(guó)Millipore公司)。

乙腈、甲醇(LC-MS級(jí),美國(guó)Sigma Aldrich公司);氨水(優(yōu)級(jí)純,美國(guó)Merck公司);12種脂溶性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均為溶解于甲醇的單標(biāo)準(zhǔn)溶液(見(jiàn)表1),購(gòu)買(mǎi)于加拿大國(guó)家海洋研究中心,-18 ℃避光保存。

表1 12種脂溶性貝類毒素質(zhì)譜參數(shù)及保留時(shí)間Table 1 Mass spectrometric parameters and retention time of the 12 lipophilic shellfish toxins

1.2 溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:分別準(zhǔn)確稱取1 mL不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇稀釋20倍,配制成混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于4 ℃保存。標(biāo)準(zhǔn)使用液:將混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液用初始流動(dòng)相逐級(jí)稀釋成標(biāo)準(zhǔn)使用液,濃度范圍見(jiàn)表2。

表2 12種脂溶性貝類毒素的檢出限、定量限、加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 2 LODs,LOQs,spiked recoveries,and RSDs of the 12 lipophilic shellfish toxins (n=6)

1.3 樣品的采集

采用便利抽樣招募捐贈(zèng)者,所有受試者均了解此次研究的目的和意義,受試者簽署同意書(shū)。小鼠經(jīng)腹腔注射12種貝類毒素后收集尿液和血液。尿液樣品使用棕色玻璃樣品瓶收集。血液樣品收集于含有肝素的5 mL采血管中,離心后取上層血漿。尿液和血漿放置于-20 ℃保存。

1.4 樣品前處理

1.4.1尿液樣品的制備

取0.3 mL尿液,加入0.9 mL乙腈后渦旋1 min,以9 000 r/min離心10 min,吸取0.4 mL上清液,加入0.4 mL超純水,渦旋30 s,過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜后上機(jī)檢測(cè)。

1.4.2血漿樣品制備

取0.2 mL血漿,加入0.6 mL乙腈后渦旋1 min,以9 000 r/min離心10 min,吸取0.4 mL上清液,加入0.4 mL超純水,渦旋30 s,過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜后上機(jī)檢測(cè)。

1.5 儀器條件

1.5.1色譜條件

色譜柱:Phenomenex Kinetex C18(50 mm×3 mm,2.6 μm);流動(dòng)相:0.05%(v/v)氨水水溶液(A相)-含0.05%(v/v)氨水的90%(v/v)乙腈水溶液(B相)。梯度淋洗程序:0～0.50 min,70%A;0.50～4.00 min,10%A;4.00～5.50 min,10%A;5.50～5.60 min,70%A;5.60～6.10 min,70%A。流速:0.40 mL/min;柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量:5 μL。

1.5.2質(zhì)譜條件

電噴霧離子源;正負(fù)離子掃描模式;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式采集。噴霧電壓:±4 500 V,離子源溫度:550 ℃,碰撞氣壓力:Medium;氣簾氣壓力:0.21 MPa(30 psi);霧化氣壓力GS1和輔助加熱器壓力GS2：0.38 MPa (55 psi)。其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。MRM圖譜見(jiàn)圖1。

2 結(jié)果與討論

2.1 UPLC-MS/MS條件的優(yōu)化

目前檢測(cè)脂溶性貝類毒素的流動(dòng)相體系主要有酸性體系和堿性體系兩種[2]。在酸性條件下(流動(dòng)相A為0.1%(v/v)甲酸+2 mmoL/L甲酸銨溶液,流動(dòng)相B為0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液),YTX、HYTX的峰形出現(xiàn)拖尾,響應(yīng)較低(見(jiàn)圖2a)。在堿性條件下(流動(dòng)相A為0.1%(v/v)氨水,流動(dòng)相B為90%(v/v)乙腈+0.1%(v/v)氨水),ESI-靈敏度提高,YTX、HYTX拖尾現(xiàn)象明顯改善,響應(yīng)值提高4倍(見(jiàn)圖2b)。

進(jìn)一步比較了流動(dòng)相中氨水的體積分?jǐn)?shù)(0.02%、0.05%、0.1%)對(duì)化合物響應(yīng)值的影響。當(dāng)流動(dòng)相中含0.05%(v/v)氨水時(shí),除PTX2外,其余化合物的響應(yīng)值最大。最終,選擇流動(dòng)相A為0.05%(v/v)氨水,流動(dòng)相B為含0.05%(v/v)氨水的90%(v/v)乙腈水溶液。

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

對(duì)于生物樣本,乙腈是最常用的提取溶劑。本研究考察了不同體積(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL)的乙腈對(duì)血漿樣品中12種貝類毒素的提取效果,結(jié)果如圖3所示。0.2 mL和0.4 mL的乙腈提取效率較低,為30%～69%;當(dāng)乙腈提取液的體積升高至0.6 mL時(shí),提取效率為78%～121%;乙腈體積繼續(xù)升高,提取效率沒(méi)有進(jìn)一步改善。因此,最終確定乙腈提取液的體積為0.6 mL。

圖 1 血漿加標(biāo)(1.0 μg/L)樣品中12種脂溶性貝類毒素的MRM譜圖Fig.1 MRM spectra of the 12 lipophilic shellfish toxins in spiked plasma samples (1.0 μg/L)

圖 2 不同流動(dòng)相體系中YTX(0.23 μg/L)和HYTX(0.30 μg/L)的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatograms of YTX (0.23 μg/L)and HYTX (0.30 μg/L) with different mobile phasesMobile phases:a.water with 0.1% (v/v) formic acid and 2 mmoL/L ammonium formate (A) and acetonitrile with 0.1% (v/v) formic acid (B);b.water with 0.1% (v/v) ammonia (A) and 90% (v/v) acetonitrile solution with 0.1% (v/v) ammonia (B).

圖 3 不同體積的提取試劑對(duì)血漿中12種脂溶性貝類毒素加標(biāo)回收率的影響(n=4)Fig.3 Effect of the extraction reagent volume on the spiked recoveries of the 12 lipophilic shellfish toxins in plasma (n=4)

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)中存在的干擾成分會(huì)產(chǎn)生基質(zhì)增強(qiáng)或基質(zhì)抑制效應(yīng),進(jìn)而影響目標(biāo)化合物的定量[15-18]。為評(píng)估基質(zhì)效應(yīng),分別采用空白尿液基質(zhì)提取液、空白血漿基質(zhì)提取液配制12種化合物的基質(zhì)校準(zhǔn)曲線,兩種曲線方程的斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的比值均在0.8～1.1之間,表明該前處理方法的基質(zhì)干擾低,采用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線可對(duì)化合物進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

2.3.2標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和靈敏度

將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按照上述色譜、質(zhì)譜條件進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,12種化合物在0.03～36.25 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.995。

以檢出限(LOD)和定量限(LOQ)評(píng)估方法的靈敏度。在尿液和血漿中添加目標(biāo)化合物,信噪比(S/N)為3∶1時(shí)確定方法的LOD為0.09～0.28 μg/L,當(dāng)S/N為10∶1時(shí)確定方法的LOQ為0.23～0.84 μg/L(見(jiàn)表2)。

2.3.3方法的精密度和準(zhǔn)確度

空白尿液和空白血漿中分別加入LOQ、2倍LOQ、10倍LOQ等3個(gè)水平的目標(biāo)化合物,每個(gè)水平進(jìn)行6次平行試驗(yàn),加標(biāo)回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)作為日內(nèi)精密度。2倍LOQ的加標(biāo)水平進(jìn)行5 d日間精密度測(cè)定。方法的回收率為72.7%～124.1%,日內(nèi)精密度為2.1%～20.0%,日間精密度為2.1%～15.3%(見(jiàn)表2)。

2.4 樣品的測(cè)定

利用本方法檢測(cè)了10份健康人尿液樣本和10份健康人血漿樣本,以及經(jīng)腹腔注射12種脂溶性貝類毒素的小鼠尿液和血漿樣品。10份人尿液樣本和10份血漿樣本均未檢出12種脂溶性貝類毒素。在10份小鼠尿液樣本中,均檢測(cè)出12種貝類毒素,含量在1.14～2.35 μg/L之間;在10份小鼠血漿樣品中,同樣檢測(cè)出12種貝類毒素,含量在1.01～1.17 μg/L之間。

3 結(jié)論

本研究分別建立了尿液和血漿中12中脂溶性貝類毒素的檢測(cè)方法,取樣量少,操作簡(jiǎn)單快速,靈敏度高,適合尿液和血漿中脂溶性貝類毒素的檢測(cè)。