張良聰, 孫 麗, 陳 敏, 黃午陽, 4, 申 麗

(1.揚州大學(xué) 醫(yī)學(xué)院/轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院, 江蘇 揚州, 225001;2.江蘇省中西醫(yī)結(jié)合老年病防治重點實驗室, 江蘇 揚州, 225001;3.揚州大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 江蘇 揚州, 225127;4.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所, 江蘇 南京, 210014)

氧化應(yīng)激是指在內(nèi)外環(huán)境有害刺激的條件下，體內(nèi)產(chǎn)生活性氧自由基和活性氮自由基所引起的細(xì)胞和組織的生理、病理反應(yīng)。氧化應(yīng)激與衰老[1]、心血管疾病[2]、腫瘤[1]、糖尿病[3]和神經(jīng)退行性疾病[4]等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。采用抗氧劑清除體內(nèi)過量的自由基，可以減少機體的氧化脅迫損傷，對延緩衰老和防治氧化應(yīng)激相關(guān)疾病具有重要的意義。微生物是抗氧化活性成分的重要來源。近年來，已從特殊生境微生物次生代謝產(chǎn)物中分離得到許多結(jié)構(gòu)新穎、具有良好抗氧化活性的化合物。從海綿共生菌Hansfordiasinuosae發(fā)酵液中分離得到新間苯二酚衍生物Hansfordiol H和Hansfordiol I, 其自由基清除活性明顯優(yōu)于Trolox(一種水溶性維生素E類似物)[5]; 從藥用植物內(nèi)生菌CytosporarhizophoraeA761中分離得到的新聚酮化合物Rhizophol A具有顯著的1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除活性，半數(shù)有效濃度(EC50)為(13.07±0.94)μmol/L[6]。

Penicilone B是從紅樹林根際土壤青霉菌PenicilliumjanthinellumHK1-6中分離得到的新嗜氮酮類化合物[7]。嗜氮酮類化合物是一類結(jié)構(gòu)新穎的真菌次生代謝產(chǎn)物，主要有10種結(jié)構(gòu)類型[8], Penicilone B在結(jié)構(gòu)上屬于帶有脂肪側(cè)鏈和芳香環(huán)的雙環(huán)嗜氮酮類化合物。嗜氮酮類化合物具有廣泛的生物活性，如抗氧化、抗病毒、抗感染、抗癌和酶抑制活性等[8-9]。前期實驗[7]發(fā)現(xiàn), Penicilone B對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(S.aureusATCC 43300和ATCC 33591)具有顯著的抑制作用，最低抑菌濃度(MIC)均為3.13 μg/mL。為進(jìn)一步分析Penicilone B的藥理活性，本研究采用2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)法、DPPH法和氧自由基吸收能力法(ORAC)測定Penicilone B的體外抗氧化活性，并首次采用量子化學(xué)密度泛函理論(DFT)，從分子結(jié)構(gòu)參數(shù)、酚羥基解離焓(BDE)、電離勢(IP)和前線分子軌道(FMO)等方面分析其抗氧化機理，以期為進(jìn)一步開發(fā)嗜氮酮類化合物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

TriStar LB941多功能酶標(biāo)儀(德國Berthold公司), UV1240紫外分光光度計(日本島津公司), L-420低速離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司), BS 224S分析天平(德國賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司), KQ-250DE數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市維誠實驗器材有限公司)。

化合物Penicilone B是陳敏博士從紅樹林根際土壤青霉菌PenicilliumjanthinellumHK1-6中分離得到的新嗜氮酮類化合物[7]，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。Trolox對照品和DPPH購自東京化成工業(yè)株式會社; 熒光素鈉購自上海瑞永生物科技有限公司; 維生素C(Vc)對照品和2, 2′-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽(AAPH)購自美國Sigma公司; ABTS購自上海麥克林生化科技有限公司; 其他試劑均為分析純。

圖1 化合物Penicilone B的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1.2 化合物ABTS自由基清除能力測定[10]

配制7 mmol/L ABTS溶液和140 mmol/L過硫酸鉀溶液，按照5 000∶88的比例混合成ABTS自由基儲備液，避光靜置16 h; 使用前在30 ℃、734 nm條件下用80%無水乙醇將其稀釋成(0.700±0.200)吸光度的ABTS工作液。在96孔板中加入10 μL不同濃度的待測化合物溶液和190 μL ABTS工作液，輕輕震蕩96孔板，室溫下避光靜置6 min, 在734 nm波長下測定各孔吸光度。Vc為陽性對照，溶劑為空白對照, ABTS工作液為陰性對照。實驗結(jié)果用ABTS自由基清除率來表示:

1.3 化合物DPPH自由基清除能力測定[11]

在96孔板中加入5 μL不同濃度的待測化合物溶液，再加入195 μL DPPH溶液(0.2 mmol/L), 37 ℃避光靜置30 min, 在517 nm下測定各孔吸光度。Vc為陽性對照，溶劑為空白對照, DPPH溶液為陰性對照。實驗結(jié)果用DPPH自由基清除率表示:

1.4 化合物氧自由基吸收能力測定[11]

氧自由基吸收能力測定，即總抗氧化能力(TEAC)測定，是公認(rèn)的評價抗氧化能力最全面的方法。在黑底96孔板中分別加入100 μL不同濃度的待測化合物溶液以及Trolox對照品，再加入50 μL熒光素鈉(0.2 μmol/L), 室溫下避光靜置15 min, 使樣品和熒光素鈉充分混合。再向各孔中快速加入50 μL AAPH(80 mmol/L), 然后立即用酶標(biāo)儀測定各孔熒光強度(激發(fā)波長為485 nm, 發(fā)射波長為535 nm), 測定溫度為37 ℃, 每隔1 min檢測1次, 共持續(xù)100 min。采用積分法在GraphPad Prism軟件上計算熒光衰退曲線下面積(AUC)。樣品衰退熒光下的凈面積(net AUC)等于樣品的AUC減去空白對照的AUC。氧自由基清除能力ORAC值(即總抗氧化能力指數(shù))為濃度梯度的樣品AUC-net AUC曲線與濃度梯度Trolox標(biāo)準(zhǔn)品AUC-net AUC曲線的斜率比, ORAC值以Trolox當(dāng)量表達(dá)，即μmol Trolox/mg。Vc為陽性對照。

1.5 DFT計算

通過Gauss View 6.0建立優(yōu)化分子模型，使用Gaussian 16在M06-2x/6-31+G**水平上對分子進(jìn)行幾何結(jié)構(gòu)全優(yōu)化，并在同等水平下對每一個穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)進(jìn)行頻率計算，確保每一個得到的結(jié)構(gòu)都不含有虛頻。使用Gaussian 16量子化學(xué)程序包進(jìn)行幾何結(jié)構(gòu)參數(shù)分析和能量計算，包括鍵長、BDE、IP、最高占據(jù)分子軌道(HOMO)和最低電子未占軌道(LUMO)能級等[12]。為了得到更加精確的單點能，采用M06-2x/Def2-TZVP方法對每一個穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的單點能進(jìn)行計算，有效避免因基組重疊誤差帶來的結(jié)果誤差。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 化合物Penicilone B的體外抗氧化活性

ABTS自由基清除能力和DPPH自由基清除能力是2種常用的體外抗氧化活性測定方法?；衔颬enicilone B對ABTS自由基和DPPH自由基具有一定的清除作用，其水平為100 μg/mL時，對ABTS自由基和DPPH自由基的清除率分別為(11.62±1.19)%、(22.68±2.81)%, 而陽性對照Vc對ABTS自由基和DPPH自由基的清除率分別為(43.17±3.88)%、(58.73±4.70)%。

ORAC法可針對親水過氧基、親脂過氧基、氫氧基、過氧亞硝基和單線態(tài)氧等多種自由基進(jìn)行綜合檢測。ORAC值越大，待測物抑制自由基生成的抗氧化能力就越強[13]。本研究ORAC法測定顯示, Penicilone B具有較好的總抗氧化能力，其ORAC值為(1.06±0.06)μmol trolox/mg, 陽性對照Vc的ORAC值為(2.87±0.15)μmol trolox/mg, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 化合物Penicilone B的DFT計算

2.2.1 化合物Penicilone B的幾何構(gòu)型及結(jié)構(gòu)參數(shù): 采用DFT方法在M06-2x/6-31+G**水平對化合物Penicilone B進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)優(yōu)化，見圖2。

圖2 化合物Penicilone B的優(yōu)化構(gòu)型

Penicilone B的C15位羥基的O原子為sp2雜化且具有1對孤對電子，易與苯環(huán)形成大π鍵。隨著大π鍵的形成，在電子離域的作用下，氧原子電荷密度降低，其對氫原子的束縛能力降低，氫原子更容易解離。同時計算發(fā)現(xiàn), Penicilone B的酚羥基鍵長為0.963 6 ?, 而一般酚羥基鍵長為0.960 0 ?, 說明Penicilone B的酚羥基比一般酚羥基要活潑，羥基氫更易于解離[14]。上述結(jié)構(gòu)特征提示Penicilone B具有一定的抗氧化活性，C15位羥基氫易于解離是其具有抗氧化能力的基礎(chǔ)。

2.2.2 BDE和IP分析: BDE 表征化合物清除自由基能力的大小[15]。為進(jìn)一步揭示Penicilone B的抗氧化機理，本研究在M06-2x/6-31+G**水平上對Penicilone B酚羥基脫氫后的苯氧自由基進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化計算，并在M06-2x/Def2-TZVP水平計算，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其BDE為356.42 kJ/mol。BDE與化學(xué)鍵的強弱直接相關(guān), BDE越小，化合物與自由基反應(yīng)時其化學(xué)鍵就越容易斷裂，抽氫反應(yīng)越容易進(jìn)行，生成的半醌式自由基的穩(wěn)定性越高，抗氧化活性越高[15]。BDE計算結(jié)果提示, Penicilone B的C15位酚羥基容易發(fā)生抽氫反應(yīng)，是其活性位點。

IP是與單電子轉(zhuǎn)移抗氧化途徑相關(guān)的重要參數(shù)。IP值越低，電子越容易轉(zhuǎn)移，抗氧化能力越強[16]。計算表明, Penicilone B的IP為1 669.14 kJ/mol。

2.2.3 化合物Penicilone B的FMO分析: 前線軌道理論表明，在化學(xué)反應(yīng)過程中, FMO發(fā)揮著重要的作用。FMO包括HOMO和LUMO。HOMO高低和失電子能力有關(guān), HOMO軌道能量越高，化合物越容易失去電子; LUMO高低和電子親和能力有關(guān), LUMO軌道能量越低，則化合物越容易得到電子[17]?！鱁(LUMO-HOMO)是HOMO和LUMO的能級差，反映了電子從HOMO到LUMO所需的能量，能級差越小，電子越容易轉(zhuǎn)移，則化合物活抗氧化性越強。此外，去質(zhì)子化過程與HOMO/LUMO附近的分子軌道(HOMO-1、HOMO-2等和LUMO+1、LUMO+2等)的躍遷過程緊密相關(guān)[18]。

本研究在M06-2x/6-31+G**水平計算Penicilone B的EHOMO、ELUMO和△E(LUMO-HOMO), 發(fā)現(xiàn)HOMO-1軌道(次高占據(jù)分子軌道)、HOMO軌道、LUMO軌道和LUMO+1軌道(次低未占據(jù)分子軌道)的能量依次增大，分別為-766.72、-692.97、-94.96和-57.71 kJ/mol; 能級差△E(LUMO-HOMO)為598.01 kJ/mol。在HOMO軌道圖中，對最高占據(jù)軌道貢獻(xiàn)最大的是Penicilone B的A環(huán)和B環(huán)上碳氧原子的p軌道；在HOMO-1軌道圖中，化合物側(cè)鏈中與酯羰基共軛的雙鍵作用最大。在LUMO軌道中, A環(huán)和B環(huán)上的電子云密度大于C環(huán)上的電子云密度，說明A環(huán)和B環(huán)接受電子的能力大于C環(huán)。見圖3。據(jù)此推測, Penicilone B可能通過與活潑自由基結(jié)合形成一個新的較為穩(wěn)定的自由基，從而終止氧化的鏈鎖反應(yīng)，發(fā)揮抗氧化作用, A環(huán)和B環(huán)是主要的反應(yīng)活性位點。

圖3 化合物Penicilone B的前線分子軌道圖

3 討 論

特境微生物是指棲息于“特殊生態(tài)環(huán)境”的微生物，近年來特境微生物次生代謝產(chǎn)物成為天然藥物研究的重要領(lǐng)域。紅樹林是生長在熱帶和亞熱帶海岸潮間帶環(huán)境中的耐鹽植物類群，是世界上最富多樣性的海洋生態(tài)環(huán)境之一。紅樹林具有豐富、特色的微生物資源，棲息于紅樹林特殊生態(tài)環(huán)境的紅樹林真菌具有獨特的代謝途徑和遺傳背景，能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、活性顯著的次生代謝產(chǎn)物[19], 為新藥研制提供了豐富的先導(dǎo)化合物。

前期實驗[7]發(fā)現(xiàn)，紅樹林根際土壤青霉菌PenicilliumjanthinellumHK1-6產(chǎn)生的新嗜氮酮類化合物Penicilone B對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(S.aureusATCC 43300和ATCC 33591)具有顯著的抑制作用。本研究采用ABTS法、DPPH法和ORAC法這3種方法評價其抗氧化活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn), Penicilone B對自由基具有一定的清除能力，表現(xiàn)出一定的體外抗氧化活性。DFT計算顯示, Penicilone B的酚羥基鍵長較長，比一般的酚羥基更易離子化，其A環(huán)和B環(huán)易接受電子，是主要的反應(yīng)活性位點，提示該化合物具有一定的抗氧化活性。DFT計算結(jié)果與體外抗氧化實驗結(jié)果相一致。

DFT是一種廣泛應(yīng)用的量子化學(xué)計算方法，可用于研究分子結(jié)構(gòu)、能譜、光譜、反應(yīng)機理、過渡態(tài)結(jié)構(gòu)和活化勢壘，其在天然藥物的抗氧化機制分析、立體構(gòu)型確定等方面也發(fā)揮著重要作用。在進(jìn)行抗氧化機制分析時, DFT計算通過計算機模擬化合物在不同反應(yīng)條件及不同狀態(tài)下的抗氧化活性，尤其是能對難以獲得的新化合物進(jìn)行分子模擬，找到其關(guān)鍵基團(tuán)，預(yù)測其抗氧化活性。本研究首次采用DFT分析嗜氮酮類化合物的抗氧化機制，為嗜氮酮類化合物的抗氧化構(gòu)效關(guān)系研究，進(jìn)一步開發(fā)嗜氮酮類化合物提供了理論依據(jù)。