朱智慧,溫 東,張 棟晁二昆,董剛強(qiáng),杜 偉,孫 偉Krzysztof Dziedzic,師玉華*,薛建平*

1.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，中藥鑒定與安全性評(píng)估北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100700

2.淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽 淮北 235000

3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040

4.安利（中國）植物研發(fā)中心，江蘇 無錫 214115

5.安捷倫科技（中國）有限公司，北京 100102

6.波茲南生命科學(xué)大學(xué) 植物源食品技術(shù)系，波蘭 波茲南 31,60-624

苦蕎Fagopyrum tataricum(L.) Gaertn 為雙子葉蓼科蕎麥屬植物，是一種重要的雜糧作物和藥食同源植物，在我國西南地區(qū)分布廣泛[1-2]?？嗍w中富含黃酮類化合物，具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等較好的藥理作用。其中蘆丁是苦蕎中特有的黃酮類化合物，具有降低毛細(xì)血管通透性，改善微循環(huán)，改善脂質(zhì)代謝及調(diào)血脂等作用[3]。早在20世紀(jì)40年代中期，苦蕎麥就被用作藥用蘆丁的重要來源，因此，苦蕎麥中蘆丁等黃酮類化合物合成及調(diào)控研究尤為重要[4]。

苦蕎中黃酮類化合物的生物合成途徑及其關(guān)鍵的合成酶研究已經(jīng)比較清晰。該合成途徑屬于苯丙烷代謝途徑（phenylpropanoid pathway）。首先，由苯丙氨酸經(jīng)過苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）、肉桂酸-4-羥化酶（cinnamate-4-hydroxylase，C4H）和4-香豆酸:輔酶A連接酶（4-coumarate：coenzyme A ligase，4CL）3步酶促反應(yīng)生成起始前體香豆酰-CoA[5]。然后，在查耳酮合成酶（chalcone synthase，CHS）、查耳酮異構(gòu)酶（chalcone isomerase，CHI）催化下轉(zhuǎn)化為柚皮素[6]。柚皮素是該途徑的主要代謝產(chǎn)物，之后進(jìn)入不同的合成分支途徑。其中一個(gè)分支經(jīng)過黃烷酮-3-羥化酶（flavanone-3-hydroxylase，F(xiàn)3H）、黃酮醇合成酶（flavonol synthase，F(xiàn)LS）和F3H 形成槲皮素，最后經(jīng)類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶（ flavonoid glycosyltransferas，GTR）催化形成蘆??；另1 個(gè)分支由二氫黃酮醇-4-還原酶（dihydroflavonol-4-reductase，DFR）、花青素合成酶（anthocyanidin synthase，ANS）、花青素復(fù)原酶（anthocyanidin reductase，ANR）進(jìn)一步還原生成兒茶素（catechin），或經(jīng)無色花色素還原酶（leucoanthocyantin reducase，LAR）催化形成表兒茶素（epicatechin）[7-8]。

植物次生代謝受遺傳因素、生物因素和溫度、光和水等非生物因素影響[9]。其中紫外光在植物光形態(tài)建成、次生代謝和葉色形成方面具有重要作用[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)，植物在受到紫外光輻射時(shí)本身會(huì)產(chǎn)生大量的次生代謝物質(zhì)來抵御紫外光的損害，這些次生代謝物質(zhì)包括苯丙素類化合物、酚類、生物堿、萜類化合物等[12-13]。例如，紫外光照射處理番茄顯著提高了其中沒食子酸、綠原酸、丁香酸、對(duì)香豆酸和槲皮素等酚類單體的含量[14]；紫外光照能夠促進(jìn)黃芪中異黃酮類化合物的積累[15]。目前，有研究報(bào)道紫外光處理影響苦蕎中黃酮類化合物的含量[16]，但是紫外光尤其是紫外線B（ultraviolet radiation B，UVB）在苦蕎中影響蘆丁等黃酮類化合物代謝的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究擬用UVB處理苦蕎幼苗，通過超高效液相色譜儀檢測紫外光處理前后苦蕎中蘆丁等黃酮類化合物含量變化，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測苦蕎中黃酮類化合物合成通路中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量，初探紫外光照射對(duì)苦蕎中黃酮類化合物的積累及其分子機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1 材料

苦蕎Fagopyrum tataricum(L.) Gaertn 種子選用晉蕎2 號(hào)，由貴州師范大學(xué)陳慶富教授鑒定并提供。對(duì)照品蘆?。–AS 號(hào)153-18-4）、兒茶素（CAS 號(hào)154-23-4）、表兒茶素（CAS 號(hào)490-46-0）均購自于Chemfaces 公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%。

1.2 儀器

UPLC-MS 系統(tǒng)，包括1290 系列超高效液相色譜儀、6470 型三重四極桿質(zhì)譜儀購自安捷倫科技有限公司；qTOWER3G 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀購自德國耶拿分析儀器股份公司；BS210S 型1/1 萬電子分析天平購自德國賽多利斯公司；紫外燈管UVB（275～320 nm，UVB10.0-43B）購自廣東華強(qiáng)電器集團(tuán)有限公司；DS-11 超微量紫外/可見分光光度計(jì)購自于美國Denovix 公司。

2 方法

2.1 UVB 處理

選取籽粒飽滿的苦蕎種子，浸泡水中約8 h 后用鑷子種入土壤中，25 ℃黑暗生長6 d。然后取一部分苦蕎幼苗放置在紫外燈UVB（波長275～320 nm，光照強(qiáng)度2 W/m2）下處理6、12、24 h，另一部分苦蕎幼苗仍在黑暗下生長，作為對(duì)照組。每個(gè)處理取10 株幼苗，做3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。最后，將處理組和對(duì)照組材料編號(hào)收集，液氮速凍后存放于?80 ℃冰箱待測。

2.2 黃酮類化合物含量測定

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取蘆丁、兒茶素、表兒茶素的對(duì)照品1 mg，加入1000 μL 70%甲醇，制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 將UVB 和對(duì)照處理后的苦蕎幼苗進(jìn)行液氮冷凍研磨成粉。用分析天平精確稱量0.1 g 樣品粉末，加入1000 μL 70%的甲醇提取劑進(jìn)行提??；然后將制備樣品1500 r/m 渦旋3 min，超聲30 min，12 000 r/min 離心10 min；離心后的樣品取上清，用0.22 μm 有機(jī)濾膜過濾樣品；最后裝入進(jìn)樣瓶，并將樣品進(jìn)行稀釋。檢測蘆丁含量時(shí)，樣品稀釋1000 倍，檢測兒茶素、表兒茶素時(shí)，樣品稀釋10 倍，備用，待測。

2.2.3 色譜條件 色譜柱為Eclipse Plus C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）；梯度洗脫：0～3.5 min，10%～45%B；3.5～3.6 min，45%～90%B；3.6～4.5 min，90%B；4.5～4.6 min，90%～10%B；4.6～6.0 min，10%～10%B。體積流量0.3 mL/min；柱溫45 ℃；進(jìn)樣量1 μL。色譜圖見圖1。

圖1 對(duì)照品 (A) 和供試品 (B) 的UPLC 圖Fig.1 UPLC chromatogram of standard solution (A) and sample (B)

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取各對(duì)照品儲(chǔ)備液，加 70%甲醇稀釋成梯度濃度，進(jìn)樣檢測，記錄色譜峰面積，以對(duì)照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)苦蕎中3 種黃酮類化合物蘆丁、兒茶素和表兒茶素進(jìn)行線性考察，r2值均大于0.999（表1）。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Table 1 Standard curve of reference materials

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下制備的1 mg/mL的對(duì)照品溶液，按照“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，結(jié)果顯示3 種化合物的對(duì)照品峰面積的RSD 在0.71%～1.75%。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，按照“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測，記錄色譜峰面積，結(jié)果顯示，3 種化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD 在0.95%～2.05%，表明方法具有良好的重復(fù)性。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，于室溫下放置，分別于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，按照“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄 3種化合物的峰面積，結(jié)果峰面積的 RSD 為在0.76%～2.15%。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已測定的苦蕎樣本9份，每份約0.05 g，精密稱定，分別精密加入低、中、高濃度（按50%、100%和150% 3 個(gè)水平）的蘆丁、兒茶素和表兒茶素對(duì)照品溶液，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行3 份，再按照“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示3 個(gè)化合物的加樣回收率在95.82%～105.65%，RSD 均小于0.3%。

以上結(jié)果表明本研究建立的檢測方法精密度高、準(zhǔn)確度好、方法穩(wěn)定，可有效用于苦蕎中這3個(gè)化合物的檢測。

2.3 RNA 提取和cDNA 制備

取苦蕎苗100 mg,按照TaKaRa 公司MiniBEST Plant RNA Extraction Kit 提取試劑盒（9769）說明書提取總RNA。用DS-11 超微量紫外分光光度計(jì)（美國 DeNovix 公司）檢測RNA 濃度。取2.5 μg總RNA，按照PrimeScript? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒（6210A），進(jìn)行第一鏈cDNA的合成，?20 ℃貯存待用。

2.4 qRT-PCR 檢測

選用PAL、C4H、CHS、CHI、FLS等11 個(gè)黃酮合成途徑的關(guān)鍵酶基因[6]。qRT-PCR 引物使用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。qRT-PCR 所用基因名稱、基因ID、引物序列、擴(kuò)增片段長度等信息詳見表2。qRT-PCR 反應(yīng)按照試劑盒Trans Start Green qPCR Super MixUDGG（北京全式金生物技術(shù)有限公司 TransGen Biotech）說明書進(jìn)行。選取Histone H3（JF769134）作為內(nèi)參基因[17]，每個(gè)樣品3 次重復(fù)，采用2?ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

表2 實(shí)時(shí)定量PCR 引物Table 2 Primers of quantitative PCR in this study

圖1 UVB 處理后苦蕎幼苗表型Fig.1 Morphological responses of tartary buckwheat seedlings under UVB radiation

3 結(jié)果與分析

3.1 UVB 處理后苦蕎苗表型及黃酮類化合物變化

為了探究紫外光對(duì)苦蕎苗中黃酮類化合物積累的影響，對(duì)黑暗培養(yǎng)6 d 的苦蕎幼苗進(jìn)行紫外光UVB 處理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UVB 照射處理6 h 后的苦蕎苗幼苗生長狀態(tài)良好，且表現(xiàn)出一些光形態(tài)建成的表型（圖1），但隨著紫外照射時(shí)間延長，苦蕎苗受到紫外損傷，開始萎蔫。因此，本研究選用紫外光UVB 處理6 h 苦蕎苗進(jìn)行黃酮類化合物含量變化。進(jìn)一步，本實(shí)驗(yàn)檢測紫外光UVB 處理前后苦蕎中這3 種黃酮類化合物的含量變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)紫外光UVB 處理6 h 后苦蕎幼苗中蘆丁、兒茶素、表兒茶素均出現(xiàn)不同程度的積累，其中蘆丁含量為對(duì)照組的1.5 倍（圖2-A），兒茶素和表兒茶素含量均約為對(duì)照組的1.3 倍（圖2-B、C）。顯著性分析表明，紫外光UVB 照射后苦蕎幼苗中蘆丁、兒茶素的含量與對(duì)照組相比呈極顯著增加；表兒茶素與對(duì)照組相比呈顯著增加。

圖2 UVB 處理后苦蕎中蘆丁 (A)、兒茶素 (B)、表兒茶素(C) 含量變化Fig.2 Changes in contents of rutin (A),catechin (B) and epicatechin (C) in Tartary buckwheat under UVB radiation

3.2 紫外光UVB 處理后苦蕎黃酮合成途徑中關(guān)鍵基因表達(dá)量變化

本研究進(jìn)一步分析苦蕎幼苗中黃酮類合成通路上關(guān)鍵基因CHS1、CHS2、C4H、F3H、DFR、F3′H、CHI、4CL、PAL、FLS、GTR的相對(duì)表達(dá)量，探究紫外光對(duì)苦蕎苗中黃酮類化合物的合成和積累的影響機(jī)制。qRT-PCR 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，紫外光UVB 處理后黃酮類合成通路上關(guān)鍵基因相對(duì)表達(dá)量均有上調(diào)（圖3-A）。其中F3′H和4CL基因的表達(dá)量顯著上升，約為對(duì)照組的8 倍，CHS1和DFR基因的相對(duì)表達(dá)量約為對(duì)照組的6 倍，其他基因的表達(dá)量與對(duì)照組相比也均上調(diào)2～3 倍（圖3-A）。黃酮合成途徑見圖3-B。

4 討論

本研究通過UVB 照射苦蕎幼苗，發(fā)現(xiàn)苦蕎中蘆丁、兒茶素、表兒茶素3 種黃酮類化合物含量均有不同程度的增加。雒曉鵬等[18]用紫外光照射苦蕎幼苗，用紫外-分光光度法檢測發(fā)現(xiàn)處理3 d的苦蕎苗與普通光照對(duì)比總黃酮類含量顯著增加，與本研究得出的結(jié)果一致。因此，紫外光UVB 有利于促進(jìn)苦蕎中黃酮類化合物的積累。張繼斌等[19]對(duì)主產(chǎn)地云南、貴州、陜西、四川的苦蕎黃酮類成分的含量分析比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)紫外光較強(qiáng)的云南產(chǎn)地的苦蕎中槲皮素等黃酮類明顯高于其他產(chǎn)地[20]。因此，推測苦蕎在受到紫外光脅迫時(shí)，機(jī)體會(huì)通過積累大量的黃酮類物質(zhì)來抵御紫外光的輻射傷害，紫外光可能是促進(jìn)苦蕎中藥用成分蘆丁等黃酮類化合物累積的關(guān)鍵環(huán)境因子之一。

圖3 UVB 處理后黃酮合成途徑中關(guān)鍵基因表達(dá)量變化(A) 及合成途徑 (B)Fig.3 Expression changes of genes involved in flavonoid synthesis pathway under UVB radiation

2017年，Zhang 等[7]發(fā)表了苦蕎的基因組，為苦蕎黃酮類化合物合成調(diào)控機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。本研究篩選了黃酮合成途徑中的11 個(gè)關(guān)鍵酶基因，通過qRT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，這11 個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)量均有不同程度的上升。其中，蘆丁合成支路上的重要關(guān)鍵酶F3′H、FLS、GTR 等明顯上調(diào)，這與紫外光UVB處理后苦蕎幼苗中蘆丁含量上升的結(jié)果相對(duì)應(yīng)；此外，實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)花青素/原花青素合成支路上的關(guān)鍵酶基因DFR 的表達(dá)量上升了6 倍，這也就解釋了紫外光UVB 處理后苦蕎幼苗中兒茶素和表兒茶素含量增加的原因。進(jìn)一步分析黃酮合成途徑上游的一些關(guān)鍵酶基因的變化，發(fā)現(xiàn)PAL、C4H、4CL、CHS1、CHS2、CHI 6 個(gè)上游的基因也均有不同程度的表達(dá)上升，說明紫外光UVB 照射不僅是影響了苦蕎黃酮類化合物合成途徑中個(gè)別基因的表達(dá)，而是誘發(fā)了整個(gè)苦蕎黃酮類化合物合成途徑中從上游到下游多個(gè)基因的表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)苦蕎體內(nèi)蘆丁、兒茶素和表兒茶素等多個(gè)黃酮類化合物的積累。有研究表明黃酮類化合物的合成與bHLH（basic helix-loop-helix）、bZIP（basic region-leucine zipper）、MYB（v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog）等家族的轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控密切相關(guān)[21-24]。研究發(fā)現(xiàn)玉米中的MYB P1和P2通過與黃酮合成途徑的關(guān)鍵酶CHS、CHI1 和DFR 等主要靶基因結(jié)合影響黃酮類化合物的合成[25]。Zhang 等[26]研究也發(fā)現(xiàn)苦蕎FtMYB116 通過與F3′H 的啟動(dòng)子結(jié)合，促進(jìn)苦蕎中蘆丁等化合物的累積。然而，苦蕎是如何響應(yīng)紫外光UVB 照射，又是通過與哪些調(diào)控因子互作來調(diào)控體內(nèi)黃酮類化合物積累的，這些機(jī)制尚不清晰，有待于進(jìn)一步的研究。植物的次生代謝調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的、動(dòng)態(tài)的過程，本研究發(fā)現(xiàn)紫UVB 能夠通過正調(diào)控苦蕎黃酮合成途徑中多個(gè)基因的表達(dá)從而促進(jìn)蘆丁、兒茶素、表兒茶素等化合物的積累，為進(jìn)一步理解苦蕎中蘆丁等黃酮類化合物的調(diào)控奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為苦蕎的育種提供了科學(xué)依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突