帖曉燕，戴海蓉，辛國雄，張?jiān)弃Q，張文廣，王 丹，李 蕓*

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000

2.平?jīng)鍪兄嗅t(yī)醫(yī)院，甘肅 平?jīng)?744000

高烏頭為毛莨科烏頭屬植物高烏頭AconitumsinomontanumNakai 的根，又稱麻布七、麻布袋、統(tǒng)天袋、穿心蓮（四川）、麻布口袋等[1]，在《中華本草》《中藥大辭典》等本草著作中均有記載，現(xiàn)收載于2009年版《甘肅省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》。高烏頭為我國中西部地區(qū)民間習(xí)用中藥，是著名的“七藥”之一[2]，高烏頭療效良好，卻因其毒性而臨床使用受限。其辛、苦、溫，有毒，具祛風(fēng)除濕、理氣止痛、活血散瘀之功，臨床上常用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和局部鎮(zhèn)痛，還可用于治療胃痛、脘腹脹滿、急慢性菌痢、急慢性腸炎等。

高烏頭含有生物堿、黃酮、甾體、糖苷類等化學(xué)成分[3-5]，現(xiàn)代藥理研究表明，其具有鎮(zhèn)痛、抗炎、局麻、解熱、抗腫瘤等廣泛作用[6-7]。目前，對高烏頭報道最多的是其化學(xué)成分研究，包括單體化合物提取、分離、衍生化等，其次是資源開發(fā)，包括人工馴化及組織培養(yǎng)等，而有關(guān)毒性藥效的研究多以高烏甲素單體為主，有效部位的研究較少[8]。目前，其理氣作用的研究尚未見報道。

辛可行氣，與胃腸運(yùn)動有一定聯(lián)系，為進(jìn)一步全面研究高烏頭石油醚部位藥效作用，更加科學(xué)地詮釋該部位藥效，本實(shí)驗(yàn)從甘草汁蒸制前后高烏頭石油醚部位的HPLC 指紋圖譜與行氣藥效的關(guān)系入手，采用灰色關(guān)聯(lián)分析[9]對譜效關(guān)系進(jìn)行研究，從而明確其行氣藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為高烏頭的開發(fā)與應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論支持。

1 材料

10 批不同產(chǎn)地或采收期高烏頭藥材，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院楊錫倉主任中藥師鑒定，為毛茛科烏頭屬植物高烏頭A.sinomontanumNakai 的干燥根，具體編號及來源見表1。

LDZX-30FA 立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；BT125D 型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；KQ3200DB 型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；FW-400A 型高建萬能粉碎機(jī)，北京科偉永興儀器有限公司；HHS-11S 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海宜昌儀器紗篩廠；1100 Series 型高效液相色譜儀，美國Agilent 科技有限公司，含DAD檢測器；SHB-3 型循環(huán)水多用真空泵，鄭州杜甫儀器廠；Buchi R-200 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士Buchi 實(shí)驗(yàn)室儀器公司。

表1 高烏頭樣品來源信息Table 1 Source information of A.sinomontanum samples

高烏甲素對照品，甘肅神龍藥業(yè)股份有限公司，批號20001001，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%；冉烏頭堿對照品，成都克洛瑪生物科技有限公司，批號150404，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%；乙腈、甲醇、三乙胺、磷酸二氫鈉，色譜純，天津大茂化學(xué)試劑廠；石油醚、乙醇，分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠；西沙比利膠囊，山東淄博新達(dá)制藥有限公司，批號180706，規(guī)格5 mg。

昆明種小鼠，SPF 級，體質(zhì)量（20±2）g，雌雄各半，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK（甘）2015-0001。飼養(yǎng)條件：甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥理實(shí)驗(yàn)室，環(huán)境溫度（23±2）℃，相對濕度50%～60%。動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)文號SYXK（甘）2015-0002。

2 方法與結(jié)果

2.1 生、制高烏頭飲片的制備

高烏頭藥材凈制潤軟后，切制約為5 mm 的片段，自然干燥，即得高烏頭生品飲片。生品飲片用10%的甘草汁（3 mL 含1 g 甘草）潤透后，置立式壓力蒸汽滅菌器內(nèi)，溫度127 ℃，壓力0.5 MPa 條件下蒸制5 h，取出晾干，即得高烏頭炮制品飲片[10]。

2.2 生、制高烏頭石油醚部位的制備

分別取生、制高烏頭飲片，加入10 倍量95%乙醇冷浸24 h 后超聲提取，超聲（功率300 W、頻率40 kHz）45 min，冷浸超聲提取2 次，濾過，合并濾液，減壓回收乙醇，即得高烏頭醇提物。所得稠膏繼續(xù)加水制成混懸液，用石油醚萃取4 次，每次200 mL，35 ℃以下減壓回收石油醚，即得生、制高烏頭石油醚部位[11-12]。

2.3 溶液的制備

2.3.1 供試品溶液制備 分別取“2.2”項(xiàng)生、制高烏頭石油醚部位浸膏0.5 g，精密稱定，加甲醇溶解，定容至10 mL，密塞，搖勻，進(jìn)樣前用0.45 μm 微孔膜濾過，即得。

2.3.2 對照品溶液制備 分別精密稱定高烏甲素、冉烏頭堿對照品8.01、2.96 mg，置于10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度線，即得高烏甲素與冉烏頭堿混合對照品溶液（含高烏甲素0.801 mg/mL、冉烏頭堿0.296 mg/mL）。

2.4 色譜條件

采用Dikma spursil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為0.05 mol/L 磷酸二氫鈉水溶液-乙腈，梯度洗脫，洗脫條件見表2，進(jìn)樣量10 μL，柱溫35 ℃，檢測波長235、254、280、290、308 nm[13-14]。

表2 HPLC 洗脫程序Table 2 Gradient procedures of HPLC

2.5 HPLC-DAD 指紋圖譜的建立

2.5.1 精密度試驗(yàn) 取適量高烏頭石油醚部位浸膏（S1），按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，連續(xù)進(jìn)樣6 次，將所得色譜圖數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）”，得到各圖譜的相似度均大于0.96，計(jì)算45 個主要共有峰相對保留時間RSD＜2%，峰面積RSD＜2%，表明此方法精密度較好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取適量高烏頭石油醚部位浸膏（S1），按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，將所得色譜圖數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）”，得到各圖譜的相似度均大于0.94，計(jì)算45 個主要共有峰相對保留時間RSD＜2%，峰面積RSD＜2%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取適量高烏頭石油醚部位浸膏（S1），按“2.3.1”項(xiàng)下方法平行制得6 份供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，將所得色譜圖數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）”，得到各圖譜的相似度均大于0.90，計(jì)算45 個主要共有峰相對保留時間RSD＜2%，峰面積RSD＜2%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.5.4 生、制高烏頭石油醚部位HPLC-DAD 指紋圖譜建立 取“2.2”項(xiàng)下制備的10 個不同批次高烏頭石油醚部位，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，每個樣品選取235、254、280、290、380 nm 5 個色譜峰信息相對豐富的波長作為匹配基準(zhǔn)，將不同波長檢測到的同一成分進(jìn)行匹配，若該成分不出峰則峰積分計(jì)0[15-16]，將其導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）”，以S1、Z1 樣品為參照圖譜，采用中位數(shù)矢量法進(jìn)行多點(diǎn)校正生成生、制高烏頭石油醚部位多波長融合HPLC-DAD 指紋圖譜（MWFF），并生成對照指紋圖譜（R），再對其進(jìn)行相似度評價。在0～110 min 內(nèi)，以穩(wěn)定性和重復(fù)性好、特征明顯的色譜峰作為共有峰。5 個不同波長下10 批生、制高烏頭石油醚部位的HPLC 圖譜、MWFF 指紋圖譜共有模式及對照指紋圖譜分別見圖1～3，生、制高烏頭石油醚部位的共有峰峰面積見表3、4。每批生、制高烏頭石油醚部位樣品非共有峰總面積占總峰面積的比值均＜10%，符合指紋圖譜要求。

圖1 10 批 (S1～S10) 生高烏頭石油醚部位的HPLC 多波長指紋圖譜Fig.1 MWFF of petroleum ether fraction of 10 batches of raw A.sinomontanum (S1—S10)

圖2 10 批 (Z1～Z10) 制高烏頭石油醚部位的HPLC 多波長指紋圖譜Fig.2 MWFF of petroleum ether fraction of 10 batches of processed A.sinomontanum (Z1—Z10)

2.6 高烏頭石油醚部位行氣作用的影響

取昆明種小鼠224 只，雌雄各半，按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)各分為16 組，每組14 只，雌雄各7 只，即對照組（0.5%甲基纖維素）、陽性組（西沙比利0.1 mg/kg），S1～S7、Z1～Z7 組，分別稱取S1～S7、Z1～Z7 組的高烏頭石油醚部位于量瓶中，加入0.5%甲基纖維素制成混懸液進(jìn)行使用，配制成3.04 mg/mL 的生品高烏頭石油醚部位混懸液及4.39 mg/mL 的制品高烏頭石油醚部位混懸液，各組小鼠按20 mL/kg 進(jìn)行ig 給藥，1 次/d，連續(xù)給藥7 d，于末次給藥前禁食12 h，給藥后30 min，每只小鼠ig 給予新鮮配制的炭末混懸液（活性炭和阿拉伯樹膠各含10%）0.4 mL，20 min 后脫頸椎處死，打開腹腔分離腸系膜，剪取上端至幽門，下端至回盲部的腸管。輕輕將小腸拉成直線，測量小腸全長與從幽門至炭末前沿的距離，計(jì)算小腸推進(jìn)率，結(jié)果見表5。

小腸推進(jìn)率＝炭末推進(jìn)長度/小腸長度

2.7 生、制高烏頭石油醚部位HPLC 圖譜與行氣作用的灰色關(guān)聯(lián)分析

圖3 生、制高烏頭石油醚部位多波長HPLC 對照指紋圖譜Fig.3 Control fingerprint of petroleum ether fractions of raw and processed A.sinomontanum

2.7.1 原始數(shù)據(jù)的無量綱化處理 原始數(shù)據(jù)的變換采用均值化變換法。變換的母序列記為{Y0(k)}，子序列記為{Yi(k)}。將生、制高烏頭石油醚部位行氣作用的藥效指標(biāo)作為母序列，生、制高烏頭石油醚部位的共有峰峰面積作為子序列。

2.7.2 絕對差序列及關(guān)聯(lián)系數(shù)的計(jì)算 在t＝k時（k為不同產(chǎn)地批次編號），母序列記為{Y0(k)}，子序列記為{Yi(k)}，母序列與子序列的絕對差序列δ0i(k)＝|Y0(k)－Yi(k)|（1≤i≤m）。計(jì)算在t＝k時母序列與子序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)η(k)。

η(k)＝(minmin|Y0(k)－Yi(k)|＋ρ·maxmax|Y0(k)－Yi(k)|)/(|Y0(k)－Yi(k)|＋ρ·maxmax|Y0(k)－Yi(k)|)

Y0(k)為生、制高烏頭石油醚部位行氣作用藥效指標(biāo)；Yi(k)為生、制高烏頭石油醚部位各共有峰峰面積歸一化數(shù)值；k為不同產(chǎn)地批次編號；i為峰號；ρ為分辨系數(shù)，在0～1 取值，若ρ越小，關(guān)聯(lián)系數(shù)間差異就越大，區(qū)分能力也越強(qiáng)，通常ρ取0.5；|Y0(k)－Yi(k)|為母序列與子序列的絕對差值；minmin|Y0(k)－Yi(k)|為絕對差值的最小值，又記為δmin；maxmax|Y0(k)－Yi(k)|為絕對差值的最大值，又記為δmax。

2.7.3 關(guān)聯(lián)度（r）的計(jì)算r實(shí)質(zhì)上是對時間序列幾何關(guān)系的比較，是母序列與子序列各個時刻的關(guān)聯(lián)系數(shù)的平均值，結(jié)果見表6、7。

m為子序列的數(shù)據(jù)個數(shù)

由表6、7 中7 批不同產(chǎn)地生、制高烏頭石油醚部位共有峰與其行氣作用的關(guān)聯(lián)分析數(shù)據(jù)可知，生品高烏頭石油醚部位各成分對行氣作用藥效貢獻(xiàn)度較大的共有峰（峰號）主要有峰40＞7＞30＞14＞36＞24＞13＞15＞33＞23＞41＞43＞9＞21＞28＞31＞37＞17＞34＞1＞20＞35＞6＞45＞3＞44＞26＞29＞11＞10＞25＞18＞2＞8＞12＞5，其中峰40、7、30、14、36、24、13、15、33、23、41、43、9、21、28、31、37、17、34 的關(guān)聯(lián)度均大于0.8，初步確定這19 個峰作為行氣作用的主要成分；制品高烏頭石油醚部位各成分對行氣作用藥效貢獻(xiàn)度較大的共有峰（峰號）主要有峰41＞29＞4＞27＞30＞33＞34＞20＞1＞45＞22＞19＞38＞31＞18＞14＞28＞35＞42＞17＞16＞32＞11＞43＞39＞10；其中峰41、29、4、27、30、33、34、20、1、45、22、19、38、31、18、14、28 的關(guān)聯(lián)度均大于0.8，初步確定這17 個峰作為行氣作用的主要成分，說明甘草汁蒸制前后高烏頭石油醚部位的行氣作用是“化學(xué)成分群”共同作用的結(jié)果，經(jīng)過與對照品和文獻(xiàn)信息進(jìn)行指認(rèn)后，確定10 號峰為高烏甲素，11 號峰為冉烏頭堿。

表3 生品高烏頭石油醚部位指紋圖譜共有峰峰面積Table 3 Common peak area of fingerprint of petroleum ether fractions of raw A.sinomontanum

表4 制品高烏頭石油醚部位指紋圖譜共有峰峰面積Table 4 Common peak area of fingerprint of petroleum ether fractions of processed A.sinomontanum

表5 生、制高烏頭石油醚部位對正常小鼠腸推進(jìn)的影響(±s,n=14)Table 5 Effects of raw and processed A.sinomontanum petroleum ether fraction on small bowel movement in normal mice (±s,n=14)

表5 生、制高烏頭石油醚部位對正常小鼠腸推進(jìn)的影響(±s,n=14)Table 5 Effects of raw and processed A.sinomontanum petroleum ether fraction on small bowel movement in normal mice (±s,n=14)

與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01*P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 vs control group

組別 推進(jìn)率/% 組別 推進(jìn)率/%對照組 57.18±10.23 S4 64.43±5.65*陽性組 70.33±5.94** Z4 63.94±7.33*S1 60.91±9.55 S5 61.89±6.60 Z1 62.03±6.28 Z5 61.23±9.36 S2 63.14±7.94 S6 64.73±8.17*Z2 66.79±6.32** Z6 64.15±7.06*S3 68.54±7.44** S7 61.81±10.34 Z3 64.89±8.13* Z7 64.80±8.80*

表6 生高烏頭石油醚部位關(guān)聯(lián)序結(jié)果Table 6 Results of correlation sequence of petroleum ether fraction of raw A.sinomontanum

表7 制高烏頭石油醚部位關(guān)聯(lián)序結(jié)果Table 7 Results of correlation sequence

3 討論

本研究對甘草汁蒸制前后高烏頭石油醚部位HPLC 指紋圖譜特征與其行氣作用量化數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，采用灰度關(guān)聯(lián)分析技術(shù)，確定了指紋圖譜特征峰所代表的的化學(xué)成分對行氣作用貢獻(xiàn)的大小。以235、254、280、290、308 nm 5 個最豐富的色譜峰為分析對象，通過對高烏頭生品及制品石油醚部位指紋圖譜色譜峰的歸屬和比較，發(fā)現(xiàn)炮制后高烏頭石油醚部位多波長融合HPLC-DAD 指紋圖譜整體圖貌、色譜峰檢出數(shù)目及各色譜峰峰面積的變化均比較明顯，具體表現(xiàn)為（1）高烏甲素與冉烏頭堿的比例由2∶1 變成1∶2；（2）比較高烏頭生、制品石油醚部位的特征色譜峰的檢出數(shù)量發(fā)現(xiàn)，制品石油醚部位新增了8 個色譜峰，消失了18 個峰，其色譜峰檢出數(shù)目的多少反映了樣品炮制前后化學(xué)成分種類的增減情況；（3）各色譜峰峰面積的變化反映了該化學(xué)成分量的變化。由圖3、表5可知，甘草汁蒸制前后高烏頭石油醚部位指紋圖譜發(fā)生了顯著改變，高烏頭石油醚部位經(jīng)甘草汁蒸制后仍然具有行氣功效；由表6、7 數(shù)據(jù)可知，生品高烏頭石油醚部位40、7、30 號峰及制品高烏頭石油醚部位41、29、4 號峰所代表的化學(xué)成分對行氣作用貢獻(xiàn)顯著（關(guān)聯(lián)度＞0.9）。

毒性中藥的炮制應(yīng)該從減毒和存效2 個方面著手。甘草汁作為一種常用的炮制輔料，其解毒作用早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載，歷代炮制有毒藥物如半夏、川烏等都用甘草解毒。在以往的烏頭類中藥配伍組方中以甘草和肉桂為多，減毒機(jī)制可能為促進(jìn)肝藥酶代謝或形成難溶性絡(luò)合物[17-18]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，甘草甜素、甘草次酸等成分是甘草減毒的物質(zhì)基礎(chǔ)，其具有在體內(nèi)或體外與毒物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)、腎上腺皮質(zhì)激素樣作用、多種藥理活性對抗中毒癥狀、調(diào)節(jié)肝臟細(xì)胞色素P450 酶系代謝以及誘導(dǎo)P-糖蛋白表達(dá)等多種解毒機(jī)制[19-25]，但其解毒機(jī)制有待深入研究。烏頭類藥材中含有大量的雙酯型生物堿，受熱的狀況下容易水解，使其毒性降低。高烏頭經(jīng)甘草汁蒸制后毒性、藥效發(fā)生變化，其根源是內(nèi)在物質(zhì)基礎(chǔ)發(fā)生了改變，炮制后消失的成分和含量降低的成分是高烏頭表現(xiàn)出“減毒”的物質(zhì)基礎(chǔ)，炮制后產(chǎn)生大量新的物質(zhì)及含量增高的成分，很可能是高烏頭“存效”的物質(zhì)基礎(chǔ)。

高烏頭含有生物堿，其石油醚部位多含揮發(fā)油，推測揮發(fā)油和生物堿類成分可能是高烏頭“辛”味物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，本研究基于石油醚部位所含化學(xué)成分的特殊性，從對胃腸運(yùn)動的作用角度切入，首次以炭末推進(jìn)實(shí)驗(yàn)探索了高烏頭行氣的功效，進(jìn)一步全面詮釋高烏頭藥效。該研究表明高烏頭石油醚部位經(jīng)甘草汁蒸制后仍然具有行氣功效，這一結(jié)果與中藥炮制存效的目的相符合。而不同產(chǎn)地高烏頭石油醚部位藥效研究比較，發(fā)現(xiàn)其行氣作用存在差異，這與中藥的藥效受區(qū)域性影響較大的觀點(diǎn)相一致[26-27]。

生品高烏頭石油醚部位40、7、30 號峰及制品高烏頭石油醚部位41、29、4 號峰，對高烏頭的藥效具有較大的影響，介于目前沒有對照品，下一步可通過質(zhì)譜等手段進(jìn)一步分析檢測并鑒定成分，為明確藥效成分提供理論基礎(chǔ)。此外，甘草汁蒸制前后高烏頭石油醚部位的行氣作用可能是多成分共同作用的結(jié)果，提示下一步的工作重點(diǎn)將是對這6種藥效成分進(jìn)行定量分析以及藥效評價等研究，以期可以進(jìn)一步明確甘草汁蒸制前后高烏頭石油醚部位行氣作用的譜效關(guān)系，為科學(xué)闡明高烏頭行氣作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供新思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突