李 楓， 李冰瀅， 謝 歡， 劉 暢， 張慶梅， 羅 彬， 葛盈盈， 農(nóng)蔚霞， 陳 芳， 謝小薰

乳腺癌(breast cancer，BRCA)是女性的最常見癌癥，也是因癌死亡的主要病因。據(jù)統(tǒng)計(jì)[1]，2018年BRCA占全球新發(fā)癌癥病例的11.6%，占癌癥死亡病例的6.6%，嚴(yán)重威脅女性的生命健康。雖然近年來BRCA的早期診斷和綜合治療策略有所進(jìn)步，使BRCA患者的預(yù)后得到了極大的改善，5年生存率最高可達(dá)98%，但仍有部分BRCA患者存在復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，如三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)，即雌激素受體(estrogen receptor，ER)狀態(tài)、孕激素受體(progesterone receptor,PR)狀態(tài)、人表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)狀態(tài)均為陰性。此類亞型目前仍缺乏有效的治療靶點(diǎn)，成為臨床治療的一大難題[2，3]。因此，深入研究BRCA的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，有助于為開發(fā)BRCA新的治療靶點(diǎn)提供參考，有重要的臨床意義。PDZ結(jié)合激酶/T-淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞來源的蛋白激酶(PDZ-binding kinase/T-LAK cell-originated protein kinase，PBK/TOPK)是癌睪丸抗原(cancer testis antigen,CTA)家族成員之一，其在正常組織中的表達(dá)僅局限于睪丸的生殖細(xì)胞和胎盤的滋養(yǎng)層細(xì)胞，在結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌和膠質(zhì)瘤等多種惡性腫瘤中高表達(dá)，與癌癥的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)[4～7]。但在轉(zhuǎn)錄水平分析其在BRCA中表達(dá)與臨床參數(shù)及預(yù)后相關(guān)性的研究較少，且由于研究方法及樣本量可能存在一定差異，部分研究結(jié)果的可靠性相對(duì)較低。鑒此，本研究通過挖掘公共數(shù)據(jù)庫(kù)轉(zhuǎn)錄組信息及患者臨床資料，分析PBK/TOPK信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid，mRNA)在BRCA中的表達(dá)情況及其與臨床參數(shù)及預(yù)后相關(guān)性，并對(duì)PBK/TOPK相似基因進(jìn)行功能富集分析，預(yù)測(cè)PBK/TOPK在BRCA中的生物學(xué)功能和潛在分子機(jī)制，為開發(fā)BRCA靶向藥物和精準(zhǔn)治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1數(shù)據(jù)資料來源與收集 數(shù)據(jù)資料主要來自O(shè)ncomine數(shù)據(jù)庫(kù)和癌癥基因組圖譜(the Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)，共包含113例正常乳腺組織和659例BRCA組織。TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)BRCA數(shù)據(jù)集納入標(biāo)準(zhǔn):(1)數(shù)據(jù)類型為mRNA測(cè)序數(shù)據(jù);(2)原發(fā)性BRCA;(3)性別為女性。排除標(biāo)準(zhǔn):臨床參數(shù)有缺失的病例。

1.2PBK/TOPK mRNA在不同腫瘤中的表達(dá)分析 應(yīng)用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析PBK/TOPK在不同腫瘤中的轉(zhuǎn)錄水平，設(shè)置篩選條件為：(1)基因:PBK;(2)分析類型:癌癥和正常組織;(3)腫瘤類型:BRCA;(4)數(shù)據(jù)類型:mRNA。參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值,調(diào)取PBK/TOPK的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)。

1.3PBK/TOPK mRNA在BRCA和正常乳腺組織中的表達(dá)分析 應(yīng)用University of California Santa Cruz Xena(以下簡(jiǎn)稱UCSC Xena)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://xena.ucsc.edu/)下載TCGA乳腺癌數(shù)據(jù)集的mRNA測(cè)序數(shù)據(jù)，分析PBK/TOPK mRNA在BRCA以及正常組織樣本中的表達(dá)差異情況，利用Graph Pad Prism7.0軟件繪制散點(diǎn)圖。

1.4PBK/TOPK mRNA表達(dá)水平與BRCA臨床特征的相關(guān)性分析 提取的臨床資料包括年齡、ER、PR、HER2、TNBC、組織學(xué)類型[包括浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(infiltrating ductal carcinoma，IDC)、浸潤(rùn)性小葉癌(infiltrating lobular carcinoma，ILC)、混合型癌、其他類型癌]、腫瘤-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移(tumor-node-metastasis,TNM)分期、絕經(jīng)狀態(tài)。以PBK/TOPK mRNA表達(dá)量的中位數(shù)值為界將研究對(duì)象分為PBK/TOPK高表達(dá)組和PBK/TOPK低表達(dá)組。

1.5生存分析 基于BRCA mRNA水平的基因芯片數(shù)據(jù)，應(yīng)用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)(http://kmplot.com/analysis/)進(jìn)行生存分析，并繪制生存曲線，采用log-rank檢驗(yàn)法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。根據(jù)PBK/TOPK表達(dá)水平的中位數(shù)將BRCA患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，分析PBK/TOPK表達(dá)與BRCA患者總生存期(overall survival,OS)和無復(fù)發(fā)生存期(recurrence-free survival,RFS)的關(guān)聯(lián)性。

1.6功能富集分析 應(yīng)用基因表達(dá)譜交互分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)檢索PBK/TOPK共表達(dá)基因，并通過Metascape(http://metascape.org/)對(duì)相似基因進(jìn)行功能富集分析，結(jié)果以條形圖和網(wǎng)絡(luò)圖展示，高度富集且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果被認(rèn)為是PBK/TOPK在BRCA中潛在的生物學(xué)功能和相關(guān)信號(hào)通路。

2 結(jié)果

2.1PBK/TOPK mRNA在不同類型腫瘤中的表達(dá)情況 應(yīng)用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析PBK/TOPK mRNA在不同腫瘤類型中的表達(dá)情況，表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的研究結(jié)果共有66項(xiàng)，其中表達(dá)增高55項(xiàng)，表達(dá)降低11項(xiàng)。在BRCA中高表達(dá)的研究9項(xiàng)，低表達(dá)的研究1項(xiàng)。見圖1。

圖1 PBK/TOPK mRNA在不同類型腫瘤中的表達(dá)情況圖

2.2PBK/TOPK mRNA在BRCA與正常乳腺組織中的比較 PBK/TOPK mRNA在BRCA組織中的表達(dá)水平顯著高于正常乳腺組織(t=28.529,P<0.001)。見圖2。

圖2 PBK/TOPK mRNA在BRCA和正常乳腺組織中的表達(dá)情況圖

2.3PBK/TOPK mRNA表達(dá)水平與BRCA患者臨床特征的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果 PBK/TOPK高表達(dá)組的ER陰性、PR陰性、TNBC和未絕經(jīng)的人數(shù)比例顯著高于PBK/TOPK低表達(dá)組(P<0.05)。PBK/TOPK高表達(dá)組與PBK/TOPK低表達(dá)組在年齡、HER2狀態(tài)、組織學(xué)類型、TNM分期方面比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.4PBK/TOPK mRNA高表達(dá)與乳腺癌不良預(yù)后關(guān)系 與PBK/TOPK mRNA低表達(dá)組相比，高表達(dá)組的OS和RFS更短(P<0.05)。進(jìn)一步分析顯示，對(duì)于ER陽(yáng)性BRCA患者，PBK/TOPK mRNA高表達(dá)組的OS和RFS更短(P<0.05)；對(duì)于PR陽(yáng)性BRCA患者，PBK/TOPK mRNA高表達(dá)組的RFS更短(P<0.05)，但兩組OS差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；對(duì)于TNBC患者，PBK/TOPK mRNA低表達(dá)組的OS更長(zhǎng)(P<0.05)，但兩組RFS差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

2.5PBK/TOPK共表達(dá)基因在BRCA中的功能預(yù)測(cè)和通路富集分析結(jié)果 為了解PBK/TOPK在BRCA中參與的信號(hào)通路及潛在生物學(xué)功能，以相關(guān)系數(shù)>0.5為標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出154個(gè)PBK/TOPK相關(guān)基因。見表2。應(yīng)用Metascape進(jìn)行功能分析，結(jié)果表明PBK/TOPK及其相似基因主要涉及BRCA細(xì)胞分裂、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和微管細(xì)胞骨架形成等生物功能，參與BRCA細(xì)胞周期等信號(hào)通路(P<0.05)。見圖4。

表1 PBK/TOPK mRNA表達(dá)水平與BRCA患者臨床特征的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果[n(%)]

??所有BRCA患者；??ER陽(yáng)性BRCA患者；??PR陽(yáng)性BRCA患者；??TNBC患者

表2 154個(gè)PBK/TOPK在BRCA中的相似基因

?功能富集條目，顏色越深表示P值越小；?功能富集分析網(wǎng)絡(luò)，不同顏色代表不同富集條目；?功能富集分析網(wǎng)絡(luò)，顏色越深表示P值越小

3 討論

3.1BRCA作為全球女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，具有增殖快、易轉(zhuǎn)移和易耐藥的特性[8]。目前BRCA的臨床治療取得了一定的進(jìn)展，已由單一治療模式逐漸轉(zhuǎn)向精準(zhǔn)治療，相比于手術(shù)和化療，靶向治療根據(jù)腫瘤特異性實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療，副作用較小，顯著提高了患者生存預(yù)后。DNA修復(fù)通路等多個(gè)潛在作用靶點(diǎn)和藥物將在BRCA治療中發(fā)揮作用，但作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究[9～11]。

3.2癌睪丸抗原PBK/TOPK最初在海拉細(xì)胞cDNA文庫(kù)中被克隆出，屬于有絲分裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase,MAPKK)家族成員。越來越多的研究[12，13]表明蛋白激酶在各種類型腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。PBK/TOPK可在有絲分裂過程中被磷酸化，參與紡錘體形成，在胞質(zhì)分裂中也發(fā)揮一定作用。此外，PBK/TOPK參與PI3K/AKT信號(hào)通路的調(diào)控，在肺癌細(xì)胞侵襲與遷移中發(fā)揮重要作用[14]。有研究[15]表明，在結(jié)腸癌細(xì)胞中PBK/TOPK通過結(jié)合p53基因的DNA結(jié)合域，抑制p53的功能，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展。Simons-Eevlyn等[16]在8種伯基特淋巴瘤細(xì)胞系及甲狀腺癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞系中都檢測(cè)到高水平表達(dá)的PBK/TOPK mRNA，在高增殖活性的惡性腫瘤患者的臨床標(biāo)本檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)PBK/TOPK mRNA表達(dá)增強(qiáng)。Singh等[17]發(fā)現(xiàn)PBK/TOPK在膀胱癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率達(dá)64.6%。PBK/TOPK在BRCA中高表達(dá),敲除內(nèi)源性PBK/TOPK可抑制BRCA細(xì)胞生長(zhǎng),導(dǎo)致胞質(zhì)分裂異常,使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[18]。本研究通過挖掘TCGA等公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明，PBK/TOPK mRNA在BRCA組織中的表達(dá)水平顯著高于正常組織，提示其可能與BRCA的惡性增殖密切相關(guān)。

3.3近年來，BRCA發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年上升且偏年輕化的趨勢(shì)，與老年BRCA患者相比，青年BRCA患者的臨床特征更具侵襲性，TNBC的發(fā)病率更高，預(yù)后較差[19]。本研究結(jié)果顯示，PBK/TOPK mRNA在年輕患者中的表達(dá)水平相對(duì)較高，PBK/TOPK mRNA高表達(dá)組的TNBC人數(shù)比例顯著高于低表達(dá)組，提示PBK/TOPK可能在年輕TNBC患者的治療中發(fā)揮重要潛能。

3.4細(xì)胞周期的失控與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。有研究[20]表明，PBK/TOPK mRNA表達(dá)與細(xì)胞周期激活的細(xì)胞比例有關(guān)。在有絲分裂期，PBK/TOPK的表達(dá)和磷酸化增強(qiáng)，被周期蛋白依賴性激酶1/細(xì)胞周期蛋白B1復(fù)合物磷酸化，正向調(diào)節(jié)PBK/TOPK蛋白與CDK1/cyclin B1的結(jié)合，這可能是PBK/TOPK蛋白定位在紡錘體纖維中的重要原因[21，22]。PBK/TOPK還能夠磷酸化組蛋白H3的Ser10位點(diǎn)，而組蛋白H3的ser10磷酸化是哺乳動(dòng)物染色體凝集的開始，是細(xì)胞有絲分裂的關(guān)鍵步驟[23]。因此，PBK/TOPK高表達(dá)可能通過影響B(tài)RCA細(xì)胞的細(xì)胞周期來促進(jìn)其增殖。Nandi等[24]發(fā)現(xiàn)，異常表達(dá)PBK/TOPK的纖維肉瘤細(xì)胞，經(jīng)阿霉素誘導(dǎo)DNA損傷后，PBK/TOPK和p53形成復(fù)合物使G2/M檢測(cè)點(diǎn)減弱，導(dǎo)致中心體復(fù)制存在缺陷及不正常的有絲分裂,阿霉素誘導(dǎo)的多倍體細(xì)胞瞬時(shí)消失而成非整倍體細(xì)胞,表現(xiàn)出細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化潛能。PBK/TOPK具有促大腸癌細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化潛能,阻斷大腸癌細(xì)胞中的PBK/TOPK表達(dá)可使細(xì)胞的致癌作用降低[25]。有研究[26]表明PBK/TOPK水平較高的BRCA患者對(duì)新輔助化療反應(yīng)不佳，預(yù)后較差。另外，也有研究[27，28]發(fā)現(xiàn)TOPK可以促進(jìn)肺癌抵抗表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)激酶抑制劑，抑制PBK/TOPK能夠提高膠質(zhì)瘤對(duì)替莫唑胺的敏感性，說明PBK/TOPK與一些治療抵抗作用相關(guān)，可能作為預(yù)測(cè)治療效果的標(biāo)志物。已報(bào)道的PBK/TOPK抑制劑，可誘導(dǎo)人肺癌異種移植模型中癌細(xì)胞的凋亡，脂質(zhì)體遞送該藥物能夠使移植瘤完全消退，而小鼠無不良反應(yīng)[29]，提示PBK/TOPK抑制劑與化療藥物的聯(lián)合應(yīng)用可能降低化療抗性，提高治療效果。

綜上所述，PBK/TOPK mRNA在BRCA中的表達(dá)水平顯著高于正常組織，與ER狀態(tài)、PR狀態(tài)、TNBC和絕經(jīng)狀態(tài)相關(guān)，PBK/TOPK mRNA高表達(dá)可提示BRCA患者預(yù)后不良。本研究還通過功能富集分析預(yù)測(cè)了PBK/TOPK參與功能和信號(hào)通路，提示PBK/TOPK可能在BRCA發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，這將為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究提供理論依據(jù)。