帥永孝， 劉 嘉， 張力引

腦組織是人體代謝率最高的器官之一，其對血液供應(yīng)的依賴非常強，對缺血缺氧也是非常敏感，在常溫條件下腦組織血流完全中斷數(shù)秒就會出現(xiàn)意識障礙，完全中斷5～8 min就會產(chǎn)生不可逆的腦損傷[1]。低溫的醫(yī)學(xué)應(yīng)用已有百余年的歷史，低溫的腦保護作用也得到了廣泛的認可,但低溫腦保護的作用機制尚未完全闡明。研究[2]表明隨著溫度的降低，腦保護作用也越明顯。不同神經(jīng)細胞對缺血缺氧的敏感性存在差異，海馬區(qū)的神經(jīng)元高度集中，對缺血缺氧性刺激非常敏感，因此本研究選擇海馬組織作為我們?nèi)毖毖跹芯康哪繕私M織。線粒體是真核細胞中重要的細胞器，線粒體的功能障礙在腦缺血后神經(jīng)損傷中起著關(guān)鍵作用[3]。研究[4]表明，低溫腦保護作用的關(guān)鍵是通過線粒體實現(xiàn)的，線粒體的功能障礙與線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)密切相關(guān)。本研究選取海馬線粒體MPTP作為研究對象探討在不同溫度條件下缺血缺氧相同的時間時各實驗組MPTP的開放狀態(tài)的差異，從MPTP的角度闡明深低溫腦保護的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 昆明醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供健康成年清潔級SD大鼠33只，雌16只，雄17只，3只作為體外循環(huán)(cardiopulmonary bypass,CPB)供血動物,30只按隨機數(shù)字表法隨機分為正常對照組、常溫停循環(huán)組和深低溫停循環(huán)組，每組10只。

1.2主要儀器與試劑 蠕動泵(江蘇常州普瑞流體技術(shù)有限公司，BL-100型)，大鼠膜式氧合器(東莞科威醫(yī)療器械有限公司)，簡便式心電監(jiān)護儀、動物肛溫表、全自動變溫水箱(昆明醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心)，各類手術(shù)器械(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科)，透射電鏡(日本JEOL公司JEM-100CX)、細胞色素C(cytochrome C,CytC)一抗(美國Millipore公司)。

1.3實驗方法

1.3.1 CPB的建立 CPB沿用上海交通大學(xué)附屬仁濟醫(yī)院神經(jīng)外科田鑫等[5]建立的大鼠深低溫CPB模型。在建立CPB前、中、后都進行監(jiān)測，記錄實驗過程中大鼠的生理指標。正常對照組：CPB建立成功后，使大鼠肛溫維持在36.8～37.0 ℃，不進行降溫和停循環(huán)，在正常體溫水平下進行CPB 20 min。常溫停循環(huán)組：在36.8～37.0 ℃進行CPB 10 min，停循環(huán)10 min。深低溫停循環(huán)組：在≤27 ℃，CPB 10 min，維持在深低溫水平停循環(huán)10 min。

1.3.2 海馬組織提取與保存 CPB結(jié)束后,迅速用斷頭取腦法提取大鼠雙側(cè)海馬組織，作好標記放入液氮罐中固定(-178 ℃)。

1.3.3 線粒體驗證與分析 各實驗組CPB全部結(jié)束后，分別提取各組海馬組織線粒體。選取提純的線粒體約0.1 g，送電鏡室進行檢測鑒定。另取適量線粒體用RIPA裂解液裂解，提取線粒體蛋白，用免疫印跡(Western blot)法以β-actin作為內(nèi)參蛋白測定海馬線粒體內(nèi)CytC，結(jié)果通過Image Lab軟件分析灰度值。CytC含量越少，MPTP開放越多。

2 結(jié)果

2.1線粒體電鏡驗證結(jié)果 提純后的線粒體用電鏡進行驗證提示線粒體純度非常高，非線粒體成分很少。正常對照組線粒體超微結(jié)構(gòu)正常，呈橢圓形，大小正常，電子密度一致，線粒體膜和嵴清晰可見；深低溫停循環(huán)組線粒體出現(xiàn)輕微腫脹，部分嵴斷裂，膜結(jié)構(gòu)較為完整，少數(shù)線粒體呈空泡改變；常溫停循環(huán)組線粒體數(shù)目減少，明顯腫脹，大量的嵴扭曲變形斷裂，內(nèi)外膜可見到破損，少數(shù)線粒體的基質(zhì)中出現(xiàn)致密、邊界不清的絮狀物。見圖1。

圖1 各組大鼠線粒體電鏡掃描圖(鉛鈾染色，×30 000)

2.2Western blot法檢測各組大鼠線粒體CytC 正常對照組CytC灰度值較深低溫停循環(huán)組和常溫停循環(huán)組高，深低溫停循環(huán)組CytC灰度值較常溫停循環(huán)組高，各組間灰度值差異明顯。見圖2。

圖2 Western blot檢測各組大鼠線粒體CytC結(jié)果圖

2.3各組大鼠線粒體內(nèi)CytC檢測結(jié)果灰度值比比較 各組灰度值比(灰度值比=CytC灰度值/β-actin灰度值)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。正常對照組、深低溫停循環(huán)組、常溫停循環(huán)組之間兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示常溫停循環(huán)組的MPTP較正常對照組、深低溫停循環(huán)組的開放明顯增加(P<0.05)；正常對照組的MPTP開放較深低溫停循環(huán)組的開放少(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠線粒體內(nèi)CytC檢測結(jié)果灰度值比比較

3 討論

3.1腦是人類最重要的器官，常溫條件下人腦能耐受的缺血缺氧時間為5～8 min，超過耐受極限時間將引起不可逆的神經(jīng)功能損害。腦部溫度的降低將降低腦組織的代謝率，提高腦對缺血缺氧的耐受性,腦溫下降1 ℃，代謝率下降6%～7%[6]。低溫通過抑制細胞內(nèi)需氧酶的活性，降低組織代謝，減少組織耗氧；抑制腦缺血誘導(dǎo)的興奮性毒性作用，減少自由基產(chǎn)生和過氧化物的合成，對維持血腦屏障和細胞膜的穩(wěn)定，起到良好的腦保護作用[7，8]。大量動物實驗及臨床研究[9,10]均證實深低溫能減輕腦損傷后的病理損害程度,促進神經(jīng)功能恢復(fù),其保護作用的機制研究也由生化、代謝水平深入至分子水平,學(xué)者開始嘗試從分子水平闡述深低溫腦保護的作用機制。

3.2線粒體是真核細胞重要的細胞器，有細胞的“能量工廠”之稱，線粒體在腦缺血缺氧后神經(jīng)元損傷中起關(guān)鍵作用，是缺血缺氧性損傷的主要目標細胞器，線粒體的功能障礙和MPTP有著密切的關(guān)系[11,12]。MPTP是位于線粒體膜上由多種蛋白組成的非選擇性復(fù)合孔道，MPTP功能的發(fā)揮是通過其不同的開放狀態(tài)來實現(xiàn)的[13]。在生理狀態(tài)下MPTP呈可逆性的間斷開放，這便于Ca2+從線粒體基質(zhì)中釋放，從而維持胞漿Ca2+的平衡。MPTP處于關(guān)閉狀態(tài)是維持線粒體內(nèi)膜低通透性、合成三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)的必要條件。在缺血、缺氧狀態(tài)下，MPTP高水平開放將直接導(dǎo)致線粒體質(zhì)子電化學(xué)梯度耗散、離子穩(wěn)態(tài)打破、細胞質(zhì)中分子量<1.5 KD的物質(zhì)都可以通過內(nèi)膜進入線粒體基質(zhì)，而基質(zhì)中合成ATP底物流失到胞質(zhì)，致使線粒體基質(zhì)腫脹，膜電位崩潰，呼吸鏈解耦聯(lián)，ATP合成減少，外膜破裂CytC釋放，最終導(dǎo)致細胞凋亡或者壞死[14,15]。

3.3本研究通過電子顯微鏡對提取的線粒體純度進行鑒定并觀察各實驗組線粒體，結(jié)果顯示提取的線粒體純度很高，含少量雜質(zhì)；線粒體大體結(jié)構(gòu)顯示各組間存在明顯差異。采用間接法通過檢測CytC來間接證明MPTP的開閉情況。在正常情況下CytC存在于線粒體內(nèi)、外膜之間的腔隙中,MPTP開放時，線粒體發(fā)生腫脹外膜破裂，CytC將從線粒體內(nèi)釋放入胞質(zhì)中，所以MPTP開放的越多，線粒體內(nèi)含的CytC就越少?？蓱?yīng)用原位免疫熒光技術(shù)或免疫組化技術(shù)檢測細胞質(zhì)或線粒體內(nèi)CytC含量變化間接反映MPTP開放情況。通過對線粒體內(nèi)CytC半定量檢測證明了缺血缺氧可致使MPTP開放，而深低溫可抑制MPTP開放保持線粒體結(jié)構(gòu)和功能的完整，保證了細胞的正常代謝活動從而起到腦保護的作用。