劉 焱， 趙曉霞， 王靖宇， 陳青宇， 仲 琳

牙周炎癥會破壞牙周支持組織，若治療不及時甚至會導致牙齒松動、脫落及口頜系統(tǒng)結構與功能受損[1]。它還與多種全身性疾病，如冠心病、糖尿病、慢性呼吸系統(tǒng)疾病、胃炎以及高血壓等的發(fā)生、發(fā)展密切相關[2]。隨著病程的進展，牙周炎癥會引發(fā)牙槽骨細胞的一系列功能學變化，甚至導致細胞凋亡，這是牙齒喪失穩(wěn)定性、咀嚼功能下降的最主要因素，因此，新生成骨對于牙周組織修復和再生尤為重要。有效治療牙周炎癥的關鍵是消除局部及全身刺激因素、控制感染，并使已喪失的牙周組織實現(xiàn)修復與再生[3]。組織工程理論、材料和技術的不斷發(fā)展給牙周支持組織再生帶來了新的機遇和挑戰(zhàn)[4]。作為牙周組織工程研究中公認的首選種子細胞——人牙周膜干細胞(human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs)具有良好的組織同源性、自我增殖活力和多向分化潛能[5]。在適宜誘導條件下，hPDLSCs可以形成牙槽骨-牙周膜-牙骨質復合體結構，實現(xiàn)真正意義上的牙周組織再生[6]。然而，干細胞治療存在著許多問題[7]：移植后生存能力降低；潛在的致瘤、致畸風險；包裝、轉運、貯存及治療方法缺乏統(tǒng)一化、標準化等。來源于間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的條件培養(yǎng)基(conditioned medium,CM)富含其旁分泌的生物活性因子,且規(guī)避了干細胞移植的各種風險,是替代干細胞治療的理想方案[8,9]。本研究通過酶消化組織塊法獲取原代hPDLSCs進行培養(yǎng)，鑒定細胞來源后制備hPDLSCs-CM。選用具有單一定向成骨分化生物學特性的小鼠胚胎成骨細胞前體細胞MC3T3-E1以hPDLSCs-CM對其進行干預，探討干預組和常規(guī)培養(yǎng)組的細胞形態(tài)特征及增殖能力的改變情況，為其在牙周組織工程的應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1實驗材料和儀器 選取16～18周歲因正畸治療需拔除的健康前磨牙及第三磨牙52顆，由包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院口腔科提供。所有牙無齲壞、無牙髓及根尖周病變，無牙周疾病，無黏膜疾病。所有納入個體無系統(tǒng)疾病?；颊咧橥獠⒑炇鹜鈺MEM培養(yǎng)基(Hyclon，美國)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(Hyclon，美國)；0.25%胰蛋白酶-乙二氨四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)(Hyclon，美國)；青霉素(河北石家莊華北制藥)；鏈霉素(河北石家莊華北制藥)；Ⅰ型膠原酶(Sigma，美國)；小鼠抗人角蛋白(pan cytokeratin，PCK)、小鼠抗人波形絲蛋白(vimentin)、小鼠抗人STRO-1單克隆抗體(Dako，丹麥)；羊抗小鼠四甲基異硫氰酸羅丹明標記的免疫球蛋白G(immunoglobulin G-tetramethyl rhodamine isothiocyanate,IgG-TRITC)熒光二抗、熒光染料Hoechst33258(Sigma，美國)；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒(碧云天)。倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)(Olympus，日本)；熒光顯微鏡(BX61+DP-71，Olympus，日本)；SpectraMax M2酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀(Molecular Devices，美國)；FACSCanto Ⅱ流式細胞儀(BD，美國)。

1.2酶消化組織塊法獲取hPDLSCs并制備hPDLSCs-CM 對待拔牙體周圍組織以75%乙醇充分消毒后，拔除牙齒，離體牙立刻置于含高倍雙抗的DMEM培養(yǎng)基，送至超凈臺。采用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)充分沖洗根面3～5次后刮取根中1/3的牙周膜，修剪為約1 mm3大小的組織塊，置于3 mg/ml的Ⅰ型膠原酶溶液中，37 ℃條件下作用1 h，離心棄上清，以含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液吹勻所得沉淀，平鋪于培養(yǎng)皿底部，置37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)2 d后予首次全量換液，后每3 d換液1次。當細胞長至鋪滿培養(yǎng)皿底部70%～80%時進行消化、傳代。當?shù)?代hPDLSCs長滿皿底約80%時，在無血清培養(yǎng)基條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集上清，即為hPDLSCs-CM，備用。

1.3免疫熒光染色法檢測vimentin、PCK及STRO-1的表達情況 制備hPDLSCs的細胞爬片，應用免疫熒光染色技術檢測細胞中vimentin、PCK和STRO-1的表達情況。PBS漂洗后，以預冷的4%多聚甲醛固定細胞30 min，1%牛血清白蛋白(albumin from bovine serum，BSA)封閉30 min，加入特異性一抗，孵育過夜。次日以PBS沖洗2～3次，避光加入二抗孵育1 h，以Hoechst33258對細胞核進行復染5 min，甘油封片、標記，鏡下觀察vimentin、PCK及STRO-1的表達情況。

1.4MC3T3-E1細胞的培養(yǎng)與干預 通過國家實驗細胞資源共享服務平臺購入MC3T3-E1細胞系，常規(guī)培養(yǎng)、傳代，選取第4代生長旺盛的MC3T3-E1細胞用于后續(xù)干預實驗。其中，干預組MC3T3-E1細胞在含50% hPDLSCs-CM +50%常規(guī)DMEM培養(yǎng)液(DMEM培養(yǎng)液+10% FBS)條件下進行培養(yǎng)；對照組在常規(guī)DMEM培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)。

1.5不同處理組MC3T3-E1細胞的增殖能力檢測 取生長狀態(tài)良好的干預組和對照組MC3T3-E1細胞，以2×104cells/cm2密度接種于96孔板中，每孔100 μl，每組設5個重復孔。按各組培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)1、3、5、7 d，培養(yǎng)結束后，每個孔加20 μl MTT溶液，37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)孵育4 h，吸棄上清后再向各孔加入150 μl DMSO，振蕩10～15 min。采用SpectraMax M2酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀測定490 nm波長處各孔吸光光度值(OD值)。

1.6不同處理組MC3T3-E1細胞的細胞周期檢測 分別收集干預組和對照組的MC3T3-E1各約3×106個，制成單細胞懸液，離心后加入70%乙醇吹打充分混勻，4 ℃過夜，每組設5個重復管。次日離心后吸棄乙醇上清，避光下各加入50 μg/ml的碘化丙錠1 ml，4 ℃環(huán)境下染色30 min，通過200目尼龍篩網，經FACSCanto Ⅱ流式細胞儀測定兩組MC3T3-E1細胞的細胞周期。

2 結果

2.1hPDLSCs的形態(tài)觀察及vimentin、PCK及STRO-1的表達情況 原代培養(yǎng)hPDLSCs 14 d可見細胞以組織塊為中心，呈環(huán)繞、散在分布，細胞形態(tài)為長梭形或多邊形、胞體豐滿，貼壁生長(見圖1?)。培養(yǎng)21 d后，細胞增多，可達80%匯合，形態(tài)均一，呈放射狀、旋渦狀緊密排列于組織塊周圍(見圖1?)。傳代后，細胞的形態(tài)特征與原代相同，呈成纖維細胞樣長梭、多角形特征，束狀整齊排布(見圖1?)。經免疫熒光染色可見hPDLSCs中vimentin陽性表達，胞漿紅染，胞核藍染(見圖2?)；PCK陰性表達，胞漿未被染色，僅見胞核藍染(見圖2?)。提示hPDLSCs為間充質來源，未有上皮細胞污染。STRO-1陽性表達，胞漿綠染，胞核藍染(見圖2?)。

?原代培養(yǎng)14 d；?原代培養(yǎng)21 d；?傳代培養(yǎng)的hPDLSCs

?vimentin表達陽性，胞漿紅染，胞核藍染；?PCK表達陰性，胞核藍染；?STRO-1表達陽性，胞漿綠染，胞核藍染

2.2兩組MC3T3-E1細胞的形態(tài)觀察結果 鏡下可見干預組和對照組細胞的形態(tài)一致、均為長梭形或多角形，細胞呈“漩渦狀”緊密排列，CM處理組的細胞數(shù)量較對照組明顯增多。見圖3。

?CM處理組；?對照組

2.3兩組MC3T3-E1細胞的增殖能力比較 兩組MC3T3-E1細胞的數(shù)量及增殖活性均隨培養(yǎng)時間的增長呈現(xiàn)上升趨勢。在培養(yǎng)第3天、第5天和第7天，干預組OD值均顯著大于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組MC3T3-E1細胞的增殖能力比較值]

2.4兩組MC3T3-E1細胞的細胞周期情況 干預組和對照組處于G0/G1期的細胞比例分別為(65.50±0.28)%和(78.82±0.86)%，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(t=32.943，P=0.000)。兩組處于G2/M+S期的細胞比例分別為(31.43±0.59)%和(19.11±0.24)%，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(t=43.393，P=0.000)。說明hPDLSCs-CM更能促進MC3T3-E1進入DNA合成期，發(fā)生細胞分裂、加速增殖。見圖4。

圖4 流式細胞儀檢測兩組細胞周期結果圖

3 討論

3.1《全國第四次口腔健康流行病學調查報告》顯示,我國成人組和老年組的牙周健康率均低于10%，55～64歲年齡段人群的牙周健康率更是僅為5%，這說明牙周病的防治已成為亟待解決的口腔健康問題。在控制感染的同時獲得牙周支持組織的再生、重建是牙周病治療的終極目標。牙周治療可以有效清除致病菌，延緩、阻止牙周炎的進展，但受制于機體修復的自限性，病變區(qū)域難以獲得牙周組織的新生[10]。引導組織再生技術雖然可以獲得一定的牙周附著和骨內缺損修復，但目前仍存在易形成長結合上皮、再生硬組織的功能較差、手術適應證窄、生物膜降解時易塌陷等問題[11]，對于牙周組織的正常結構和功能的構建，遠未達到醫(yī)師和患者所期望的理想結果。

3.2相較于傳統(tǒng)治療方法，組織工程技術利用干細胞的定向分化潛能發(fā)揮修復作用，給牙周組織修復和再生提出了新思路。有研究[12]通過體內示蹤植入的MSCs發(fā)現(xiàn)，僅有<1%的干細胞歸巢并定植于病變缺損區(qū)發(fā)揮促進組織再生的作用，而絕大多數(shù)的MSCs僅附著于待修復組織的表面，這說明直接發(fā)揮生物學功能、參與組織再生和修復的主要細胞并不是MSCs。另有研究[13]表明，比起“分化、替代受損細胞”，再生過程中移植的干細胞主要通過旁分泌機制釋放多種生物活性分子(如趨化因子、生長因子等)，從而構建、優(yōu)化局部微環(huán)境，趨化病變周圍的健康干細胞/祖細胞遷徙至損傷部位進行增殖、分化，減少受損細胞發(fā)生凋亡和炎性反應，促進組織新生血管，并可通過調節(jié)細胞免疫功能等多重效應誘導組織再生。Osugi等[14]將人MSCs-CM作用于小鼠顱骨缺損模型，經CT檢查發(fā)現(xiàn)，干預后顱骨骨量生成增多；同時體內細胞示蹤技術發(fā)現(xiàn)，經MSCs-CM處理后被標記的小鼠MSCs遷移到病變缺損區(qū)的細胞量顯著增多，并能檢測到明顯的血管新生。上述研究結果均表明MSCs-CM可以調動內源性MSCs的歸巢，并能正向調節(jié)血管新生和新骨形成。

3.3本研究通過酶消化組織塊法獲得hPDLSCs，并經免疫熒光染色證實所得細胞呈現(xiàn)vimentin陽性表達、PCK陰性表達的狀態(tài)，說明其來源于間充質，而非上皮來源。目前尚無明確的研究結論給出一種或幾種特殊的hPDLSC標志物。2004年，Seo等[5]最早成功分離獲得hPDLSCs，并使用早期間MSCs的標志物STRO-1等作為其標志物。本研究也發(fā)現(xiàn)所得hPDLSCs呈現(xiàn)STRO-1陽性表達，以此驗證細胞來源。

3.4MC3T3-E1細胞具有單一定向成骨分化的各種生物學特性，因而被廣泛應用于成骨相關的體外細胞實驗研究中[15]。MC3T3-E1細胞形態(tài)符合成纖維細胞樣特性，為長梭形或多角形，生長特性為貼壁生長。經hPDLSCs-CM干預作用后，MC3T3-E1細胞形態(tài)與常規(guī)培養(yǎng)組的細胞形態(tài)一致，均為長梭形或多角形，說明hPDLSCs-CM不會導致MC3T3-E1細胞形態(tài)特征發(fā)生改變。類似結果在許多干細胞條件培養(yǎng)基的研究中被證實[7,14]，這可能與MSCs的旁分泌功能密切相關。MSCs生長過程中會將一些活性物質，如生長因子、血管生成因子、激素、細胞因子、細胞外基質蛋白、細胞外基質蛋白酶和激素等分泌到培養(yǎng)環(huán)境中，這些活性物質不僅對維持干細胞自身的未分化狀態(tài)和存活具有關鍵作用，還可以影響其他細胞的生長和(或)功能，保持其原有的典型的細胞形態(tài)，且不會明顯改變細胞體積[16]。細胞增殖能力是反映生物學活性的重要指標之一，組織的生長、修復與重建都需要依靠細胞的增殖來完成[17]。本研究通過MTT法和細胞周期分析檢測hPDLSCs-CM對MC3T3-E1細胞增殖活力的影響，結果顯示，hPDLSCs-CM干預可促進MC3T3-E1細胞增殖，且可正向促進MC3T3-E1細胞進入DNA合成期，加速細胞發(fā)生有絲分裂。類似結果也在其他的體內、外實驗中得以證實。Hendudari等[18]發(fā)現(xiàn)聯(lián)合骨髓MSCs-CM與激光有利于人皮膚成纖維細胞在高糖培養(yǎng)基中的生長。Nagata等[19]將牙周膜干細胞CM植入大鼠牙周缺損組織，獲得了較好的牙周組織再生，并且缺損的再生效果與條件培養(yǎng)液的濃度顯著相關。這些效應與MSCs-CM的趨化性能、免疫調節(jié)功能、細胞生長支持功能、抗細胞凋亡及血管生成功能等相關，但具體的機制尚無定論，有待進一步研究。

綜上所述，本實驗證實了hPDLSCs-CM干預可在不改變MC3T3-E1細胞形態(tài)特征的情況下增強其增殖能力。為研究干細胞衍生物CM應用于牙周疾病及修復骨組織缺損的臨床治療提供了參考依據。但是，本研究對于具體干細胞培養(yǎng)液的內容物質沒有進行深入檢測，后續(xù)實驗還將進一步在體外細胞水平及牙周炎的動物模型中驗證hPDLSCs-CM對于成骨效應所發(fā)揮的作用。