李丹丹 ，陳吳越 ，周昊言，呂 翔，周 婧?，馬宏躍?，王恒斌，狄留慶，段金廒

（1.南京中醫(yī)藥大學，江蘇省方劑高技術研究重點實驗室／江蘇省中藥資源產業(yè)化過程協同創(chuàng)新中心，江蘇南京 210023；2.雷允上藥業(yè)集團有限公司，江蘇蘇州 215009）

動物藥蟾酥含有復雜的化學成分，包括蟾蜍甾烯類、蟾毒色胺類、吲哚生物堿類、甾醇類以及氨基酸、多肽類等成分［1-3］。現代藥理學研究表明蟾酥及其活性成分具有抗腫瘤［4-5］、強心［6］、鎮(zhèn)痛［7］、抗菌［8］及抗炎［9］等作用，臨床常用于惡性腫瘤、心血管等疾病治療［10-11］。除了口服使用外，蟾酥外用治療癌痛、瘡瘍、皮膚感染、帶狀皰疹疼痛、牙痛等［12-13］，歷史悠久，特色鮮明，療效出眾。

蟾酥藥材多為片酥，臨床調劑或者成藥制劑前，需要進行炮制（或粉碎）處理。傳統炮制方法［14］，包括宋代鐵上焙焦（《太平圣惠方》 ）、酒燉（《婦人良方大全》 ）；明代有湯浸（《普濟方》 ）、乳汁制等。目前2020 年版《中國藥典》（一部）規(guī)定蟾酥粉炮制方法為酒制［15］，取蟾酥，搗碎，加白酒浸漬，時常攪動至呈稠膏狀，干燥，粉碎。每10 kg 蟾酥，用白酒20 kg［16］。片酥質地堅硬，粉碎困難，古代酒制的主要目的是便于片狀蟾酥粉碎，隨著現代科技的發(fā)展，實際生產中由于酒制方法繁瑣，常使用打粉機進行粉碎處理。蟾酥酒制除了便于粉碎外，是否還具有其他方面的功用，目前尚未知曉?？紤]到蟾酥中甾烯類成分具有較好的脂溶性，相比水溶性物質更容易透皮吸收，是蟾酥外用的重要功效物質。前期課題組對商品蟾酥含量測定結果顯示脂蟾毒配基、沙蟾毒精、華蟾毒它靈、蟾毒它靈、華蟾酥毒基是市售藥材及飲片中含量較高的成分。但目前對這幾種蟾蜍甾烯類成分在酒制前后含量變化的研究缺乏一定的系統性。且鮮有對蟾酥酒制前后甾烯成分外用透皮吸收的研究。本實驗選擇蟾酥中6 種含量較高且具活性的蟾蜍甾烯成分為指標，采用HPLC 法對酒制前后該類成分進行定量分析，并通過體外Franz 擴散池法測定酒制前后其透皮吸收比率，探究酒制對蟾酥中蟾蜍甾烯類成分的影響，以期為蟾酥炮制提供科學依據。

1 材料

Agilent 1290 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；TK-12D 型透皮擴散試驗儀（上海鍇凱科技貿易有限公司）。對照品蟾毒靈、脂蟾毒配基、華蟾酥毒基實驗室制備，純度＞98.0%；沙蟾毒精（180427）、華蟾毒它靈（180318）、蟾毒它靈（180419），純度均＞98.0%，均購于北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司。甲醇、乙腈為色譜純，購于德國Merck 公司。24 批蟾酥藥材購自全國不同產地（江蘇、安徽、山東、吉林、重慶），經南京中醫(yī)藥大學藥學院馬宏躍教授鑒定為蟾蜍的干燥分泌物。

實驗動物，雄性豚鼠，體質量250～300 g，購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場，許可證號SCXK（蘇）2017-0011。

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取脂蟾毒配基、華蟾酥毒基、蟾毒靈、沙蟾毒精、蟾毒它靈、華蟾毒它靈對照品粉末適量，加入甲醇制備成質量濃度為10 mg／mL 的對照品貯備液。取適量貯備液，逐級稀釋成不同質量濃度的混合對照品溶液，4 ℃下離心（14 000 r／min）20 min，取上清。

2.1.2 樣品溶液 精密稱定蟾酥粉末（過24 目篩）15 mg，置具塞錐形瓶中，加入甲醇溶液定容，稱定質量，超聲提取1 h。放冷，再稱定質量，用甲醇溶液補足減失的質量，搖勻后，4 ℃下離心（14 000 r／min）20 min，取上清，經0.22 μm 微孔有機濾膜過濾，即得。

2.2 酒制樣品溶液 根據2020 年版《中國藥典》規(guī)定，參照袁旭江等［17］正交優(yōu)化后的蟾酥酒制工藝進行炮制，蟾酥打粉（過24 目篩）后加入白酒（紅星二鍋頭，20180916）60 ℃下浸漬12 h（蟾酥和白酒比例為1 ∶2），攪拌至稠膏狀，80 ℃干燥后粉碎，按“2.1.2”項下方法制備蟾酥酒制品溶液。

2.3 體外透皮實驗 將實驗豚鼠處死后，8%硫化鈉脫毛，剝離豚鼠皮膚并除去皮下脂肪、血管，生理鹽水沖洗，冷藏備用，實驗前檢查皮膚完整性。采用TK-12D 藥物透皮擴散儀研究蟾酥的透皮吸收。接收池中含有10% 乙醇的生理鹽水。接收池用磁力攪拌器在以（37 ± 0.5）℃，以400 r／min 勻速攪拌。在給藥60 min 后，取下給藥區(qū)域皮膚，用10%乙醇洗去皮膚表面藥物殘留。將皮膚磨碎，甲醇超聲提取，離心取上清液過膜，測定皮膚內滲入的蟾酥甾烯含量。

2.4 色譜條件 色譜條件參照《蟾酥商品藥材的品質評價及質量標準草案建立》［18］中優(yōu)化條件，采用Waters XBridge C18色譜柱（100 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流動相乙腈（A）-0.2% 磷酸水（B），梯度洗脫（0～6 min，20%～25% A；6～12 min，25%～30% A；12～24 min，30%～35% A；24～34 min，35%～40% A；34～35 min，40%～90% A；35～37 min，90% A；37～38 min，90%～20% A；38～42 min，20% A）；柱溫35 ℃；體積流量0.7 mL／min；檢測波長296 nm。

3 實驗結果

3.1 蟾酥酒制前后特征圖譜分析 取蟾酥供試品溶液（S1～S24）、蟾酥酒制品供試溶液（J1-J24），通過液相色譜進樣分析，將各批次蟾酥色譜圖、蟾酥酒制品色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版）。以S1 為參照圖譜，時間窗設為0.1 s，采用中位數法生成對照圖譜。由圖1 可知，蟾酥和蟾酥酒制品HPLC 特征圖譜基本一致，二者均具有16 個共有峰，但部分化學成分峰面積存在一定差異，即質量有所不同。

3.2 方法學考察

3.2.1 線性關系考察 取“2.1.1”項下稀釋不同倍數的混合對照品溶液，在“2.4”項條件下進樣，以質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，得回歸方程，結果見表1。

表1 各成分線性關系Tab.1 Linear relationships of various constituents

3.2.2 精密度試驗 取“2.1.1”項下混合對照品溶液，在“2.4”項條件下進樣6 次，測得沙蟾毒精、蟾毒它靈、華蟾毒它靈、蟾毒靈、脂蟾毒配基、華蟾酥毒基RSD 分別為0.24%、0.71%、0.40%、0.36%、0.29%、0.42%，表明儀器精密度良好。

3.2.3 重復性試驗 取樣品TJ-2 粉末6 份，按“2.1.2”項下方法制備樣品溶液，在“2.4”項條件下進樣，測得沙蟾毒精、蟾毒它靈、華蟾毒它靈、蟾毒靈、脂蟾毒配基、華蟾酥毒基RSD 分別為 1.46%、0.74%、1.39%、0.45%、0.45%、0.46%，表明該方法重復性良好。

3.2.4 穩(wěn)定性試驗 取樣品TJ-2 粉末，按“2.1.2”項下方法制備樣品溶液，在“2.4”項條件下，分別于0、2、4、8、12、24 h 進樣，測得沙蟾毒精、蟾毒它靈、華蟾毒它靈、蟾毒靈、脂蟾毒配基、華蟾酥毒基RSD 分別為0.72%、2.33%、0.31%、0.49%、0.36%、0.47%，表明樣品溶液在24 h 內穩(wěn)定性良好。

3.2.5 加樣回收率試驗 精密稱取6 份TJ-2 粉末，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入一定量的對照品溶液，按“2.1.2”項下方法制備溶液，在“2.4”項條件下進樣，測得沙蟾毒精、蟾毒它靈、華蟾毒它靈、蟾毒靈、脂蟾毒配基、華蟾酥毒基加樣回收率（RSD）分別為100.54%（3.10%）、103.34%（2.90%）、99.75%（3.61%）、102.03%（2.56%）、98.72%（1.57）%、101.19%（2.14）%。

3.3 酒制前后樣品含量測定 在“2.4”項條件下，HPLC-UV 含量測定結果見圖2，24 批蟾酥中6種蟾蜍甾烯的平均質量分數為14.39%，酒制后平均質量分數為13.87%，下降率3.62%。蟾酥經過酒制后，6 種蟾蜍甾烯類成分的質量分數略有下降，下降比率從1.63%～7.29%。下降比率接近或大于5%的分別是沙蟾毒精和脂蟾毒配基。

圖2 24 批蟾酥酒制前后6 種甾烯含量測定結果Fig.2 Results of content determination of six bufadienolides in twenty-four batches of toad venom before and after processing

3.4 蟾酥酒制前后對體外透皮吸收的影響 蟾酥酒制前后體外透皮吸收結果見表2，結果表明，與蟾酥相比，酒制蟾酥后6 種蟾蜍甾烯類成分的透皮吸收率均有所下降，其中沙蟾毒精和脂蟾毒配基下降率最大，分別為26.19%、20.72%。

4 討論

蟾酥臨床用藥前需要進行炮制處理。2020 年版《中國藥典》 中規(guī)定蟾酥用酒進行炮制。參考以往酒制工藝研究結果，本實驗確定的酒制法操作為蟾酥打粉后加入白酒，60 ℃下浸漬12 h（蟾酥和白酒比例為1 ∶2），攪拌至稠膏狀，80 ℃干燥后粉碎。

通過對蟾酥及酒制蟾酥HPLC 特征圖譜進行比較，發(fā)現兩者在色譜峰數量上沒有差異，在峰面積方面略有差異。含量分析表明，蟾酥酒制后6 種甾烯成分含量均有下降，影響最大的為沙蟾毒精和脂蟾毒配基。體外透皮實驗發(fā)現，酒制后各甾烯成分透皮吸收率有所下降，對沙蟾毒精和脂蟾毒配基影響較大。蟾酥作為成分復雜的動物藥，含有復雜的蛋白多肽類成分，推測可能是由于蟾酥中其他成分如多肽類成分在酒制后發(fā)生變化從而影響其透皮吸收。

表2 蟾酥中6 種蟾蜍甾烯類成分酒制前后質量變化及透皮吸收率的變化（，%）Tab.2 Variations in content and transdermal absorption of six toad venom constituents before and after processing（，%）

表2 蟾酥中6 種蟾蜍甾烯類成分酒制前后質量變化及透皮吸收率的變化（，%）Tab.2 Variations in content and transdermal absorption of six toad venom constituents before and after processing（，%）

總的來說，片酥質地堅硬，粉碎困難，酒制的主要目的是便于片狀蟾酥粉碎。同時蟾酥甾烯過量攝入有潛在心臟毒性，酒制對于減低蟾酥的毒性有積極意義。本實驗考察了蟾酥酒制對藥材中6 種甾烯成分含量以及透皮吸收比率的影響，酒制后，一方面小幅降低甾烯的含量；另一方面，通過使蟾酥中蟾毒蛋白變性，總體上提高了藥材的安全性。