陳海琳，周永明，朱文偉，陸 皓，曾 慶

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200437）

骨髓增生異常綜合征是由造血細(xì)胞異?？寺?dǎo)致的腫瘤性疾病，常表現(xiàn)出異常分化潛能，導(dǎo)致血細(xì)胞減少，并有發(fā)展為急性髓性白血病的傾向［1］，其每年發(fā)病率為每10 萬人中3～4 人，以老年患者居多［2］。近二十年來，雖然相關(guān)治療策略不斷優(yōu)化，但預(yù)后、生存整體情況仍不理想［3］。

研究表明，免疫異常與骨髓增生異常綜合征的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Aggarwal 等［4］認(rèn)為，該疾病早期或低危型患者NK 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫效應(yīng)細(xì)胞及Th17 過度激活，調(diào)節(jié)型T 細(xì)胞活性減弱，造血細(xì)胞過度凋亡。高?；颊邉t可觀察到骨髓微環(huán)境呈免疫抑制狀態(tài)，造血細(xì)胞異常克隆增多，導(dǎo)致疾病進(jìn)展。近年來，具有免疫抑制和／或調(diào)節(jié)功能的B 細(xì)胞亞群對人類腫瘤免疫調(diào)控成為研究熱點［5］，但關(guān)于調(diào)節(jié)性B 細(xì)胞（Breg）在骨髓增生異常綜合征發(fā)生發(fā)展中影響的研究相對較少，它通常表達(dá)IL-10 和其他抗炎介質(zhì)，產(chǎn)生免疫抑制效應(yīng)［6］。上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院采用加味健脾補(bǔ)腎解毒方治療骨髓增生異常綜合征多年，臨床療效顯著，本研究考察該方聯(lián)合常規(guī)治療對患者Breg 細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子IL-10、TGF-β1、IL-4、IFN-γ 的影響，以期為中西醫(yī)結(jié)合臨床治療該疾病提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2017 年1 月至2018 年11 月收治于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院血液科門診及住院就診的骨髓增生異常綜合征患者，西醫(yī)診斷按世界衛(wèi)生組織（WHO）2016 年髓系腫瘤診斷分型骨髓增生異常綜合征的診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行［7］；中醫(yī)辨證參照國家中醫(yī)藥管理局血液病重點?？扑瓒緞谥嗅t(yī)分型標(biāo)準(zhǔn)并適當(dāng)合并，分為正虛毒蘊型、毒盛正虛型，其中前者面色無華，氣短乏力，自汗或盜汗，五心煩熱，重者衄血或便血，或皮膚紫斑，舌淡嫩苔少，脈虛大無力，或面色蒼白或虛浮，納呆便溏，腰膝酸軟，畏寒怕冷，重者衄血或便血，或皮膚紫斑，舌淡胖苔水滑，脈沉細(xì)，西醫(yī)預(yù)后分型中的相對低危組（IPSS-R-極低危組、低危組和中危組）大多歸屬于該證型；后者時有發(fā)熱，汗多，常見衄血或便血，或皮膚紫斑，口干口苦，喜飲，大便干結(jié)，小便黃赤，伴有神疲乏力，舌紅苔黃，脈洪數(shù)，西醫(yī)預(yù)后分型中的相對高危組（IPSS-R-高危組、極高危組）大多屬于該證型。

根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出45 例骨髓增生異常綜合征患者，其中相對低危組（正虛毒蘊型）26 例，相對高危組（毒盛正虛型）19 例，隨機(jī)分為對照組（15 例）和觀察組（30 例），其中對照組男性8 例，女性7 例，平均年齡（61.67±16.70）歲，而觀察組男性24 例，女性6 例，平均年齡（65.77±10.98）歲，2 組年齡、性別組成比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。根據(jù)中醫(yī)辨證診斷標(biāo)準(zhǔn)，2 組又可分為正虛毒蘊型組、毒盛正虛型組，其中對照組分別為9、6 例，而觀察組分別為17、13 例，組間診斷危度匹配比較，差異也無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），具有可比性。另選15 例無惡性血液病及免疫性疾病、過敏性疾病病史的健康體檢成人作為正常組。研究經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（批號2017-015）。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) ①符合骨髓增生異常綜合征的西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)；②經(jīng)2 名具有高級職稱的中醫(yī)血液病專家辨證，符合相關(guān)中醫(yī)證型；③年齡≥18 歲；④入選時停用化療藥物、造血生長因子或糖皮質(zhì)激素等2 周以上；⑤無經(jīng)抗生素或抗病毒藥物治療不能控制的活動性感染；⑥患者自愿接受本方案治療，并簽署知情同意書。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) ①過敏體質(zhì)或?qū)ο嚓P(guān)治療藥物過敏；②合并嚴(yán)重心臟病，包括心肌梗死、心功能不全3 級以上；③合并肝腎功能嚴(yán)重異常；④合并具有臨床意義的其他系統(tǒng)疾病，包括酗酒、吸毒、精神異常、智力障礙；⑤依從性差或因各種原因終止治療可能性大、不能完成療程。

1.4 治療手段

1.4.1 對照組 采用常規(guī)治療。其中相對低危組口服沙利度胺片（常州制藥廠有限公司，國藥準(zhǔn)字H32026129，25 mg／粒），每天50 mg，每晚1 次，或來那度胺膠囊（正大天晴藥業(yè)集團(tuán)，國藥準(zhǔn)字H20193006，10 mg／粒），每天10 mg；十一酸睪酮膠丸（美國默沙東公司，進(jìn)口藥品注冊證號H20140962，40 mg／粒），每次40 mg，每天3 次，而相對高危組給予去甲基化治療，靜脈注射注射用地西他濱（正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20120067，25 mg／瓶），每天20 mg／m2，連續(xù)5 d，以28 d 為1 個周期，或皮下注射注射用阿扎胞苷（正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20193278，100 mg／瓶），每天75 mg／m2，連續(xù)5 d，以28 d 為1 個周期。合并感染時，采用敏感抗生素抗感染；合并出血時，采用注射用矛頭蝮蛇血凝酶（蓬萊諾康藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20041419）、維生素C 等止血；血小板＜2.0×1010／L 并有明顯出血時，輸注單采血小板懸液；合并重度貧血（血紅蛋白＜50 g／L），輸注紅細(xì)胞懸液；合并粒細(xì)胞缺乏（中性粒細(xì)胞低于0.5×109／L）時，皮下注射粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）或粒巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）以刺激粒系增殖，并加強(qiáng)控制感染，兩者使用劑量均為每天5～10 μg／kg。以3 個月為1 個療程，治療2 個療程以上后進(jìn)行臨床評價。

1.4.2 觀察組 在對照組基礎(chǔ)上加用加味健脾補(bǔ)腎解毒方，組方藥材黃芪、女貞子、太子參、炒白術(shù)、炒白芍、菟絲子、制半夏、牡丹皮、蛇舌草、半枝蓮、景天三七、炒枳殼、炙甘草等，脾腎陽虛者，酌加杜仲、桑寄生、仙靈脾、補(bǔ)骨脂等；脾腎陰虛者，酌加生地黃、炒黃柏、鱉甲等；瘀毒者，酌加蛇莓、白英、水牛角、赤芍等；出血明顯者，酌加仙鶴草、茜草、槐花、焦山梔等，上述中藥飲片均購自醫(yī)院中藥房，符合2015 年版《中國藥典》 相關(guān)規(guī)定，由醫(yī)院制劑室加工，濃煎2 次，取藥液200 mL（不加任何添加劑），真空分裝，每袋100 mL。每次1 袋，每天2 次，早晚餐后30 min服用。以3 個月為1 個療程，治療2 個療程以上后進(jìn)行臨床評價。

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 外周血CD25+CD86+Breg 細(xì)胞比例 清晨在無菌條件下抽取患者外周血4 mL，EDTA 抗凝，F(xiàn)icoll 分離液分離外周血單個核細(xì)胞，細(xì)胞離心后收集，細(xì)胞凍存液重懸，存盒置于-80 ℃冰箱中長期保存，檢測前取出復(fù)蘇。采用流式細(xì)胞儀，檢測患者及正常人群外周血CD25+CD86+Breg 細(xì)胞比例。

1.5.2 外周血IL-10、TGF-β1、IL-4、IFN-γ 水平治療前后清晨在無菌條件下抽取患者外周血各4 mL，分為2 管，EDTA 抗凝，1 000 ×g 離心15 min左右，收集上清液，分裝后置于-80 ℃下保存，檢測前解凍。采用ELISA 法，檢測IL-10、TGF-β1、IL-4、IFN-γ 水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 軟件進(jìn)行處理，由于骨髓增生異常綜合征的異質(zhì)性較明顯，所測數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布，故每組數(shù)據(jù)均以中位數(shù)及四分位間距［P50（P25，P75）］表示，組間比較采用兩獨立樣本W(wǎng)ilcoxon 秩和檢驗。

2 結(jié)果

2.1 CD25+CD86+Breg 細(xì)胞比例

2.1.1 正常人群與患者 與正常組比較，骨髓增生異常綜合征組外周血CD25+CD86+Breg 細(xì)胞比例升高（Z ＝2.473），見表1。

表1 正常組、骨髓增生異常綜合征組CD25+CD86+Breg細(xì)胞比例比較［P50（P25，P75）］Tab.1 Comparison of CD25+CD86+Breg cell proportions between the normal group and the myelodysplastic syndromes group ［P50（P25，P75）］

2.1.2 正虛毒蘊型與毒盛正虛型 與正常組比較，相對低危組CD25+CD86+Breg 細(xì)胞比例雖有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Z ＝1.633，P＞0.05），而相對高危組有顯著差異（Z ＝2.936，P＜0.05），見表2。

表2 相對低危組、相對高危組CD25+CD86+Breg 細(xì)胞比例比較［P50（P25，P75）］Tab.2 Comparison of CD25+CD86+Breg cell proportions between the relative low-risk group and the relative high-risk group ［P50（P25，P75）］

2.2 IL-10、TGF-β1、IL-4、IFN-γ 水平

2.2.1 正常人群與患者 與正常組比較，骨髓增生異常綜合征組IL-10、TFG-β1、IL-4、IFN-γ 水平升高（Z ＝5.230，P ＜0.01；Z ＝4.711，P ＜0.01；Z ＝4.702，P ＜0.01；Z ＝4.711，P ＜0.01），見表3。

表3 正常組、骨髓增生異常綜合征組IL-10、TGF-β1、IL-4、IFN-γ 水平比較［P50（P25，P75）］Tab.3 Comparison of IL-10，TGF-β1，IL-4 and IFN-γ levels between the normal group and the myelodysplastic syndromes group ［P50（P25，P75）］

2.2.2 正虛毒蘊型與毒盛正虛型 與正常組比較，相對低危組IL-10、TGF-β1、IL-4、IFN-γ 水平升高（Z ＝3.600，P ＜0.01；Z ＝3.072，P ＜0.01；Z ＝2.788，P＜0.01；Z ＝3.749，P＜0.01），相對高危組亦然（Z ＝4.008，P＜0.01；Z ＝3.746，P＜0.01；Z ＝3.903，P＜0.01；Z ＝3.937，P＜0.01）；與相對低危組比較，相對高危組四者水平升高（Z ＝2.252，P＜0.05；Z ＝2.252，P＜0.05；Z ＝2.275，P＜0.05；Z ＝2.229，P＜0.05），見表4。

2.2.3 治療前與治療后 治療前，對照組、觀察組IL-10、TGF-β1、IL-4、IFN-γ 水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Z ＝1.553，P＞0.05；Z ＝1.108，P＞0.05： Z ＝0.831，P＞0.05；Z ＝1.673，P＞0.05）；治療后，觀察組IL-10、IL-4、IFN-γ 水平降低（Z ＝3.178，P ＜0.05；Z ＝2.008，P ＜0.05；Z ＝2.622，P＜0.01），TGF-β1 水平無明顯變化（Z ＝1.635，P＞0.05），而對照組四者水平均無明顯變化（Z ＝0.682，P ＞0.05；Z ＝0.609，P ＞0.05；Z ＝-1.193，P ＞0.05；Z ＝1.874，P ＞0.05），見表5。

表4 相對低危組、相對高危組IL-10、TGFβ1、IL-4、IFN-γ 水平比較［P50（P25，P75）］Tab.4 Comparison of IL-10，TGF-β1，IL-4 and IFN-γ levels between the relative low-risk group and the relative high-risk group ［P50（P25，P75）］

表5 觀察組、對照組IL-10、TGF-β1、IL-4、IFN-γ 水平比較［pg／mL，P50（P25，P75）］Tab.5 Comparison of IL-10，TGF-β1，IL-4 and IFN-γ levels between the observation group and the control group［pg／mL，P50（P25，P75）］

3 討論

Breg 細(xì)胞是具有免疫調(diào)節(jié)或免疫抑制特性B細(xì)胞的特殊亞群，主要通過分泌抑制性細(xì)胞因子（如IL-10、TGF-β、IL-35 等）調(diào)節(jié)炎癥，維持體內(nèi)免疫平衡［8-9］，并可通過分泌TGF-β 將CD4+T 細(xì)胞轉(zhuǎn)化為調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Tregs），從而抑制T 細(xì)胞增殖，增加腫瘤轉(zhuǎn)移，而腫瘤細(xì)胞可誘導(dǎo)Breg 細(xì)胞產(chǎn)生并抑制抗腫瘤免疫過程［8，10］。人類Breg 細(xì)胞表面有多種抗原，分泌IL-10 仍是最佳表型標(biāo)記［8］。研究表明，CD25+CD86+Bregs 在共培養(yǎng)后高表達(dá)IL-10、TGF-β，對CD4+T 細(xì)胞抑制作用明顯，建議可將其作為人Bregs 細(xì)胞研究［11］。

本研究發(fā)現(xiàn)，骨髓增生異常綜合征患者外周血CD25+CD86+Bregs 比例明顯高于正常人群，主要以相對高危組（即高?；颊撸└@著，而且外周血相關(guān)細(xì)胞因子IL-10、TGF-β1 水平也明顯更高，并也以相對高危組更顯著。由此可知，Breg 細(xì)胞比例及IL-10、TGF-β1 水平升高與骨髓增生異常綜合征病理狀態(tài)及病情進(jìn)展有關(guān)，檢測上述指標(biāo)可監(jiān)測疾病發(fā)展，對判斷預(yù)后有重要意義。

IL-4 是最重要的Th2 細(xì)胞因子，可促進(jìn)惡性膠質(zhì)瘤、卵巢癌、肺癌、乳腺癌等多種類型腫瘤增殖和存活，并能誘導(dǎo)T 細(xì)胞無反應(yīng)性、T 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性喪失，促進(jìn)腫瘤和疾病進(jìn)展［12］，但鮮有骨髓增生異常綜合征與其相關(guān)性的研究。本研究發(fā)現(xiàn)，骨髓增生異常綜合征患者血清IL-4 水平明顯升高，以高?；颊吒@著，推測該細(xì)胞因子可能也參與該疾病。

另外，許多研究已經(jīng)注意到骨髓增生異常綜合征患者細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子水平異常［1，13］；本實驗發(fā)現(xiàn)，與正常人群比較，患者血清TGF-β1、IFN-γ 水平明顯升高，與前期報道相符。

加味健脾補(bǔ)腎解毒方是上海市名老中醫(yī)周永明教授治療骨髓增生異常綜合征的有效經(jīng)驗方，本研究發(fā)現(xiàn)在常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用該方對改善患者外周血Hb、WBC、PLT 計數(shù)及骨髓病態(tài)造血，減少輸血依賴或頻度均有較顯著的作用，并可明顯減低不良反應(yīng)發(fā)生率［14］。從中醫(yī)角度分析，骨髓增生異常綜合征具有“脾腎虧損為本、火傷血絡(luò)為標(biāo)、邪毒內(nèi)襲為變”的病機(jī)特征，而加味健脾補(bǔ)腎解毒方可“健脾補(bǔ)腎以固本，瀉火止血以治標(biāo)，清解邪毒以防變，采用變法以求功”，臨床多年實踐取得較好療效。研究結(jié)果顯示，常規(guī)治療后骨髓增生異常綜合征患者外周血IL-10、TGF-β1、IL-4、IFN-γ 水平無明顯變化，而加用加味健脾補(bǔ)腎解毒方后IL-10、IL-4、IFN-γ 水平顯著降低，其機(jī)制可能與拮抗患者機(jī)體三者過表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，外周血Breg 細(xì)胞比例及IL-10、TGF-β1、IL-4、IFN-γ 水平升高可能參與了骨髓增生異常綜合征病理變化，而加味健脾補(bǔ)腎解毒方聯(lián)合常規(guī)治療有利于抑制上述細(xì)胞因子的異常變化，緩解病情進(jìn)展，具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。