田 忠,劉 茜,朱 莉,劉 文,朱 芬,王小平

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,昆蟲資源利用與害蟲可持續(xù)治理湖北省重點實驗室,武漢 430070)

滯育是昆蟲借以度過不良環(huán)境、維持種群延續(xù)的一種生存對策，主要由遺傳因子和環(huán)境因子共同調(diào)控(Danks,1987)。依據(jù)昆蟲進入滯育的生活史階段可分為胚胎滯育、幼蟲滯育、蛹滯育和成蟲滯育，成蟲滯育又稱作生殖滯育(Danks,1987)。當(dāng)具生殖滯育特性的昆蟲接受到光周期、溫度等外部環(huán)境信號的刺激后，會通過內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)昆蟲激素滴度的變化以促進滯育的發(fā)生(Denlingeretal.,2012)。保幼激素(juvenile hormone,JH)是由昆蟲咽側(cè)體(corpus allatum,CA)中合成的一種倍半萜類化合物，參與了昆蟲發(fā)育、變態(tài)、生殖、滯育等諸多生理事件(周樹堂等,2012;Jindraetal.,2013)。前人在淡色庫蚊Culexpipiens(魯加龍等,1993;Kangetal.,2014)、始紅蝽Pyrrhocorisapterus(Smykaletal.,2014)、七星瓢蟲Coccinellaseptempunctata(劉夢姚等,2019)等眾多生殖滯育型昆蟲中已經(jīng)證實，保幼激素信號的缺乏是雌成蟲順利進入并維持滯育的關(guān)鍵因素，而咽側(cè)體內(nèi)JH的合成調(diào)控對昆蟲順利完成生殖滯育準備至關(guān)重要(Denlingeretal.,2012)。

促咽側(cè)體素(allatotropin,AT)和抑咽側(cè)體素(allatostatin,AST)是由昆蟲腦分泌的兩種重要的CA活性調(diào)節(jié)劑，雖然只在較短的時段內(nèi)發(fā)揮效應(yīng)，卻能有效激活或抑制一系列酶促反應(yīng)，從而促進或抑制CA中JH的合成(劉艷等,2007;Stay and Tobe,2007)。前人的研究發(fā)現(xiàn)，對煙草天蛾Manducasexta的CA外源施加AT能顯著促進JH的合成(Lietal.,2002)，沉默淡色庫蚊的AT也能有效抑制雌成蟲卵巢的發(fā)育，促使個體由生殖向生殖滯育的轉(zhuǎn)變(Kangetal.,2014)。而抑咽側(cè)體素(ASTs)分別屬于AST-A(Cockroach ASTs或FGL amides),AST-B[Cricket ASTs或W(X)6W amides]和AST-C(ManducaASTs或PISCFs) 3個不同的家族(Bendenaetal.,1999;Gilbertetal.,2000)，其種類和功能在不同的昆中存在較大的差異。例如，紅頭麗蠅Calliphoravomitoria的AST-A對自身CA不具敏感性，卻對太平洋折翅蠊Diplopterapunctata的CA中JH合成具有顯著的抑制效果(Duveetal.,1994)；雙斑蟋蟀Gryllusbimaculatus的AST-A和AST-B雖然均對自身JH合成具有明顯的抑制效果，但AST-B的抑制效果顯著高于AST-A(Lorenzetal.,1995)；而對埃及伊蚊Aedesaegypti的離體CA施加純化獲得內(nèi)源性的AST-C也能明顯抑制CA活性(Lietal.,2006)。這些研究表明，AT和AST確實可以增強或抑制CA的活性以調(diào)節(jié)JH的合成速率，但其是否也能通過調(diào)控JH合成以促進或抑制昆蟲的生殖滯育準備，仍缺乏明確證據(jù)。

本研究以一種可被長光照誘導(dǎo)進入生殖滯育的十字花科蔬菜害蟲——大猿葉蟲Colaphellusbowringi為模型開展研究。前期研究發(fā)現(xiàn)，JH信號在大猿葉蟲生殖和滯育的決定的調(diào)控中發(fā)揮著舉足輕重的作用，低水平的JH通過抑制大猿葉蟲雌成蟲卵黃原蛋白(vitellogenin,Vg)基因Vg1和Vg2的表達以抑制卵巢的發(fā)育，從而促進滯育的發(fā)生(Liuetal.,2016)。本研究克隆大猿葉蟲CbAT,CbAST-B和CbAST-C基因，再通過RNAi和qRT-PCR等技術(shù)，明確CbAT和CbASTs在滯育與非滯育雌蟲頭部的表達差異；檢測其對JH合成途徑的乙酰-CoA乙酰轉(zhuǎn)移酶(acetyl-CoA acetyltransferase)基因AACT，法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase)基因FPPS，以及JH合成限速酶保幼激素酸O-甲基轉(zhuǎn)移酶(juvenile hormone acid O-methyltransferase)基因JHAMT以及受JH的誘導(dǎo)表達Krüppelhomolog1(Kr-h1)基因和保幼激素酯酶(juvenile hormone esterase)基因JHE1的表達變化以指示JH信號水平的變化(Noriega,2014;Zhuetal.,2017)；同時檢測卵黃原蛋白合成基因Vg1和Vg2表達量變化，探究其在其生殖滯育準備期對JH信號以及卵黃積累的調(diào)控功能，以期為進一步明確昆蟲滯育的上游調(diào)控路徑、挖掘害蟲防治新靶標(biāo)提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

供試大猿葉蟲Colaphellusbowringi成蟲(約500頭)于2017年11月采自江西省修水縣(29°1′N,114°4′E)。在智能人工氣候箱(HP-250-GS，武漢瑞華儀器設(shè)備有限公司)中，以新鮮的長羽裂蘿卜Raphanussativusvar.longipinnatus葉片飼養(yǎng)2019年秋季滯育解除的大猿葉蟲成蟲，獲得繁殖個體。在溫度25℃和RH 70%的飼養(yǎng)條件下，大猿葉蟲幼蟲期約為8 d，蛹期約為4 d(薛芳森等,2002)，蛹期可進行雌雄鑒別(Wangetal.,2006)。飼養(yǎng)溫度25℃和光周期12L∶12D時，可獲得注定非滯育個體，雌成蟲4日齡前為產(chǎn)卵前期，期間卵巢內(nèi)卵黃原大量積累而脂肪積累較少；飼養(yǎng)溫度25℃和光周期16L∶8D時，可獲得注定滯育個體，雌成蟲4日齡前為滯育準備期，此期間卵巢發(fā)育受到抑制而脂肪體內(nèi)積累大量脂質(zhì)(Xueetal.,2002;Wangetal.,2004;Tanetal.,2016)。

1.2 基因鑒定、克隆及序列分析

利用前期建立的大猿葉蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(Tanetal.,2015)，鑒定大猿葉蟲CbAT和CbASTs基因，通過NCBI網(wǎng)站在線工具ORFfinder(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)搜索其開放閱讀框(ORFs)，并利用ExPASy在線翻譯工具Translate(http:∥web.expasy.org/translate/)對其進行氨基酸的序列轉(zhuǎn)換。利用Premier 5.0軟件設(shè)計試驗所需引物(表1)。克隆目的基因PCR反應(yīng)體系及條件參照TransTaqDNA Polymerase High Fidelity試劑盒(TransGen Biotech)說明書，將目標(biāo)片段進行膠回收(AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒,Axygen)并連接pMD18-T載體(TaKaRa)后測序以驗證序列正確性。

基于NCBI的Protein數(shù)據(jù)庫(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)中檢索獲得的不同物種AT和AST氨基酸序列，并利用Blast工具(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)與其他物種氨基酸序列進行相似度比較，再通過MEGA 6.6軟件中鄰接(neighbor-joining)法進行系統(tǒng)進化分析。利用ExPASy在線軟件pI/Mw(https:∥web.expasy.org/compute_pi/)分別對大猿葉蟲CbAT,CbAST-B和CbAST-C蛋白質(zhì)的等電點和分子量進行預(yù)測。

1.3 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

對1.1節(jié)飼養(yǎng)的供試大猿葉蟲注定滯育與注定非滯育2-3日齡雌蛹、初羽化雌成蟲(定義為0日齡)和1-4日齡雌成蟲頭部(去除觸角)剪下，液氮速凍于無RNA酶離心管中，每樣本大于10頭，重復(fù)3次。將樣品用液氮研磨至粉末后，利用Trizol法進行總RNA的提取，具體步驟可參考RNAiso Plus(TaKaRa)說明書。

利用1.0 μg獲得的總RNA進行cDNA合成，具體方法與步驟參照Prime Script RT Reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)進行。

1.4 qRT-PCR檢測目的基因表達

將1.3節(jié)反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA用ddH2O稀釋20倍后，用于目的基因表達量檢測。供試qRT-PCR引物序列及擴增效率等信息參考(表1)。qRT-PCR方法參照實驗室前期在大猿葉蟲中建立的平臺(Liuetal.,2016)，以RPL19和Actin1作為內(nèi)參基因(Tanetal.,2015)，利用SYBR Premix Ex Taq II(TaKaRa)進行體系配制，并在LightCycler 96(Roche)程序上完成數(shù)據(jù)采集及分析。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.5 RNA干擾

基因的RNAi試驗方法參考前期建立的大猿葉蟲RNAi平臺(Liuetal.,2016)。利用表1中RNAi引物對CbAST-B和CbAST-C的dsRNA區(qū)段進行PCR擴增，連接pMD18-T載體(TaKaRa)后測序以驗證序列正確性。參照1.2節(jié)方法，利用測序正確后的pMD18-T-CbAST-B和pMD18-T-CbAST-C以及實驗室前期構(gòu)建的pGEX-4T-GFP為模板，分別對CbAST-B,CbAST-C和GFP基因進行PCR擴增后，切膠回收獲得3個基因的dsRNA合成模板，并測定濃度；分別取1.0 μg的CbAST-B,CbAST-C和GFP的dsRNA合成模板，參照T7 RNA Polymerase(Invitrogen)方法合成dsRNA。

將200.0 nL的質(zhì)量為2.0 μg的CbAST-B和CbAST-C的dsRNA注射至注定滯育2日齡雌蛹腹腔。對于CbAST-B和CbAST-C基因的混合RNA干擾試驗，每個基因2.0 μg的dsRNA均勻混合為200.0 nL，然后注射到蟲體中。所有RNAi實驗均以dsGFP為對照。RNAi后，按1.1節(jié)方法飼養(yǎng)至4日齡雌成蟲，剪下雌成蟲頭部(去除觸角)并解剖脂肪體，均置于無RNA酶離心管中，每樣本組織大于10頭，液氮速凍置于-80℃冰箱保存，同時觀察卵巢發(fā)育情況。依據(jù)1.3節(jié)方法對樣品進行總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，再利用qRT-PCR(同1.4節(jié))檢測頭部(去除觸角)樣品中的目標(biāo)基因的沉默效率以及JH合成基因AACT(GenBank登錄號:MT977124),FPPS(GenBank登錄號:MT977125)和JHAMT(GenBank登錄號:MT977123)以及脂肪體中JH應(yīng)答基因Kr-h1(GenBank登錄號:KX753345.1)和JHE1(GenBank登錄號:KY229689.1)和卵黃原蛋白基因Vg1(GenBank登錄號:KU516007.1)和Vg2(GenBank登錄號:KU516008.1)的表達量變化。

1.6 數(shù)據(jù)分析

基因的相對表達量計算采用2-ΔΔCT法(Schmittgen and Livak,2008)，基于3次生物學(xué)重復(fù)。基因的相對表達量數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為平均值±標(biāo)準差，其差異顯著性分析均采用SPSS 11.5軟件中獨立樣本t測驗(independent samplest-test)進行，再利用GraphPad Prism 8.0繪圖。

2 結(jié)果

2.1 大猿葉蟲CbAT和CbASTs基因的鑒定與序列特征

在大猿葉蟲轉(zhuǎn)錄組中，鑒定到一個促咽側(cè)體素基因CbAT(GenBank登錄號:MT977128)和兩個抑咽側(cè)體素基因CbAST-B(GenBank登錄號:MT977126)和CbAST-C(GenBank登錄號:MT977127)，ORF分別長408,600和303 bp，分別編碼135,199和100個氨基酸，預(yù)測等電點分別為9.57,6.53和9.18，預(yù)測蛋白分子量分別為15.67,23.21和11.64 kD。

2.2 大猿葉蟲CbAT和CbASTs蛋白的系統(tǒng)進化分析與多重序列比對

為了進一步鑒定大猿葉蟲中CbAT,CbAST-B和CbAST-C的同源基因，本研究分別對這3個基因的氨基酸序列進行系統(tǒng)進化分析和序列的同源比對。研究發(fā)現(xiàn)，利用不同物種AT蛋白構(gòu)建的有根的系統(tǒng)發(fā)育進化樹中，不同目的昆蟲之間在分支上彼此分離，大猿葉蟲的CbAT與赤擬谷盜Triboliumcastaneum的TcAT聚為一支，所有昆蟲AT均與非昆蟲外群物種大型溞Daphniamagna親緣關(guān)系最遠(圖1:A)。與鞘翅目、雙翅目、膜翅目以及直翅目等昆蟲AT進行氨基酸序列多重比對發(fā)現(xiàn)，大猿葉蟲CbAT的氨基酸序列具備保守的TARGF(Y)G區(qū)域以及典型的KR位點(Veenstra and Costes,1999)，其序列與赤擬谷盜、埃及伊蚊以及歐洲熊蜂Bombusterrestris的AT的序列一致性分別為32.6%,22.5%和20.8%(圖2:A)。再分別以大型溞的DmAST-B和挪威龍蝦Nephropsnorvegicus的NnAST-C為外群構(gòu)建昆蟲的ASTs進化樹，大猿葉蟲CbAST-B和CbAST-C分別處于昆蟲AST-B和AST-C兩大基因家族分支下，并與鞘翅目昆蟲在小分支上距離最近(圖1:B,C)。同時，通過氨基酸序列的多重序列比對發(fā)現(xiàn)，大猿葉蟲CbAST-B和CbAST-C的氨基酸序列中均具備多個經(jīng)典的KR位點，其中CbAST-B具有6個典型的W(X)6W結(jié)構(gòu)，分別為WNRDLSMW-amide,WNNIHGGW-amide,WQKFQGGW-amide,WNKFTDGW-amide,WDNFRGTW-amide和WTNLKGMW-amide，且大多W(X)6W的碳(C)端都具有一個甘氨酸(Glycine,G)殘基(圖2:B)；而CbAST-C同樣具備典型序列區(qū)段RFRA(Q)CYFNPV(I)SCF(圖2:C)，且在YFNPVS兩端的兩個半胱氨酸(Cysteine,C)形成一個二硫鍵橋(Mengetal.,2015)。另外，CbAST-B與馬鈴薯甲蟲Leptinotarsadecemlineata、赤擬谷盜以及堆沙白蟻Cryptotermessecundus序列一致性分別為62.0%,52.7%和27.0%(圖2:B)，而CbAST-C與赤擬谷盜、黑腹果蠅Drosophilamelanogaster和家蠶的AST-C氨基酸序列一致性分別為30.9%,23.6%和25.0%(圖2:C)。以上進化樹和氨基酸序列比對分析結(jié)果表明，本研究獲得的3個基因分別是大猿葉蟲CbAT,CbAST-B和CbAST-C的同源基因。

圖1 基于氨基酸序列的大猿葉蟲CbAT (A),CbAST-B (B)和CbAST-C (C)蛋白的系統(tǒng)進化分析(鄰接法)Fig.1 Phylogenetic analysis of CbAT (A),CbAST-B (B) and CbAST-C (C) proteins in Colaphellus bowringi based on the amino acid sequences by neighbor-joining method蛋白來源物種及GenBank登錄號Origin species of proteins and their GenBank accession numbers:LmAT:東亞飛蝗Locusta migratoria (AKN21240.1);SgAT:沙漠蝗蟲Schistocerca gregaria (AKC92815.1);BmAT:家蠶Bombyx mori (XP_021207265.1);MsAT:煙草天蛾Manduca sexta (AAB08759.1);CpAT:淡色庫蚊Culex pipiens (AHG94987.1);AaAT:埃及伊蚊Aedes aegypti (AAB06179.1);BtAT:歐洲熊蜂Bombus terrestris (XP_003398476.1);HsAT:印度跳蟻Harpegnathos saltator (XP011135972.1);CbAT:大猿葉蟲Colaphellus bowringi (QNT17938);TcAT:赤擬谷盜Tribolium castaneum (EFA09244.2);DmAT:大型溞Daphnia magna (JAN79122.1);HhAST-B:茶翅蝽Halyomorpha halys(XP_024219541.1);PsAST-B:小珀椿象Plautia stali (BAU88428.1);CsAST-B:二化螟Chilo suppressalis (ALM30300.1);SfAST-B:草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda (ALM30300.1);AaAST-B:埃及伊蚊Aedes aegypti (AAB06179.1);DaAST-B:銀額果蠅Drosophila albomicans (XP_034105339.1);TcAST-B:赤擬谷盜Tribolium castaneum (XP_008191729.1);CbAST-B:大猿葉蟲Colaphellus bowringi (QNT17936);LdAST-B:馬鈴薯甲蟲Leptinotarsa decemlineata (AIW62335.1);DmAST-B:大型溞Daphnia magna (XP_032788834.1);HaAST-C:棉鈴蟲Helicoverpa armigera (AGH25547.1);BmAST-C:家蠶Bombyx mori (BAG68396.1);PsAST-C:小珀椿象Plautia stali (BAV78790.1);NlAST-C:褐飛虱Nilaparvata lugens (BAO00971.1);LdAST-C:馬鈴薯甲蟲Leptinotarsa decemlineata (AIW62334.1);CbAST-C:大猿葉蟲Colaphellus bowringi (QNT17937);TcAST-C:赤擬谷盜Tribolium castaneum (EFA09152.2);DmAST-C:黑腹果蠅Drosophila melanogaster (NP_523542.1);LcAST-C:銅綠蠅Lucilia cuprina (XP_023293632.1);NnAST-C:挪威龍蝦Nephrops norvegicus (BX89028.1).

2.3 CbAT和CbASTs在注定滯育和注定非滯育大猿葉蟲不同發(fā)育階段頭部中的表達差異

CbAT在大猿葉蟲注定非滯育3日齡雌成蟲頭部出現(xiàn)表達高峰(圖3:A)，而CbAST-B和CbAST-C分別在注定滯育2和4日齡雌成蟲頭部出現(xiàn)表達高峰(圖3:B,C)。在整個注定滯育與注定非滯育2日齡雌蛹到4日齡雌成蟲期間，CbAT基因始終無表達差異(圖3:A)；而CbAST-B和CbAST-C分別自雌成蟲1和2日齡開始在注定滯育個體顯著高表達(P<0.05)，且表達差異一直持續(xù)到滯育準備期結(jié)束(圖3:B,C)。

圖3 CbAT (A),CbAST-B (B)和CbAST-C (C)在注定滯育和注定非滯育大猿葉蟲不同發(fā)育階段雌蟲頭部中的相對表達量Fig.3 Relative expression levels of CbAT (A),CbAST-B (B) and CbAST-C (C) in the head of the diapause-destined and non-diapause-destined females of Colaphellus bowringi at different developmental stages2-3dP:分別為2-3日齡雌蛹2-day-old and 3-day-old female pupa,respectively;0dA:初羽化雌成蟲Newly emerged female adult;1-4dA:分別為1-4日齡雌成蟲1-4-day-old female adult,respectively.圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準差，基于3次生物學(xué)重復(fù)。nsP>0.05;*P<0.05;**P<0.01(獨立樣本t檢驗)。Data in the figure are mean±SD based on three biological replicates.nsP>0.05;*P<0.05;**P<0.01 (independent samples t-test).下同The same below.

2.4 沉默CbASTs基因?qū)H信號基因表達的影響

為進一步明確CbASTs基因在大猿葉蟲滯育準備調(diào)控中的功能，本研究分別沉默CbAST-B，CbAST-C以及共同沉默CbAST-B+CbAST-C，并檢測JH合成基因AACT,FPPS和JHAMT以及JH的應(yīng)答基因Kr-h1和JHE1的表達量變化。研究發(fā)現(xiàn)，無論是單獨沉默CbAST-B和CbAST-C，還是同時沉默CbAST-B和CbAST-C，均有較高的沉默效率，達到72.8%～96.8%(圖4)。另外，AACT,FPPS,JHAMT,Kr-h1和JHE1的表達均被不同程度顯著上調(diào)(圖5)。這些結(jié)果表明，沉默CbAST-B或CbAST-C基因可顯著促進JH合成基因的表達。

圖4 注定滯育大猿葉蟲4日齡雌成蟲頭部的CbAST-B (A),CbAST-C (B)和CbAST-B+CbAST-C (C) RNAi效率檢測Fig.4 RNAi efficiency of CbAST-B (A),CbAST-C (B) and CbAST-B+CbAST-C (C) in the head of the diapause-destined 4-day-old female adults of Colaphellus bowringi dsGFP為對照。dsGFP was used as the control.下同The same below.

圖5 沉默CbAST-B (A,D),CbAST-C (B,E)和CbAST-B+CbAST-C (C,F)對注定滯育大猿葉蟲4日齡雌成蟲JH信號基因表達的影響Fig.5 Effects of knocking down CbAST-B (A,D),CbAST-C (B,E) and CbAST-B+CbAST-C (C,F) on the expression of JH signaling genes in the diapause-destined 4-day-old female adults of Colaphellus bowringi檢測去除觸角的頭部樣品中JH合成基因AACT,FPPS和JHAMT以及脂肪體樣品中JH應(yīng)答基因Kr-h1和JHE1的表達量。The expression levels of JH biosynthesis genes AACT,FPPS and JHAMT in head samples without antenna and JH-responsive genes Kr-h1 and JHE1 in fat body samples were determined.

2.5 沉默CbASTs基因?qū)Υ笤橙~蟲卵黃原蛋白基因表達和卵巢發(fā)育的影響

為了進一步明確CbAST-B和CbAST-C介導(dǎo)的保幼激素信號能否調(diào)節(jié)大猿葉蟲滯育準備，在注定滯育的大猿葉蟲中沉默CbASTs觀察卵巢發(fā)育程度并檢測了卵黃原蛋白基因Vg1和Vg2的表達量變化。研究發(fā)現(xiàn)，沉默干擾CbAST-B,CbAST-C和CbAST-B+CbAST-C后，大猿葉蟲4日齡注定滯育雌成蟲脂肪體中Vg1和Vg2的表達均被顯著上調(diào)(圖6:A,B,C)，但雌成蟲卵巢發(fā)育程度均未沒有明顯的促進效果，卵巢管仍呈現(xiàn)絲狀或膨大狀且無明顯的卵黃積累(圖6:D)。推測在注定滯育的大猿葉蟲中，CbAST-B和CbAST-C抑制了脂肪體內(nèi)Vg1和Vg2的表達，有限地抑制了雌成蟲卵巢的發(fā)育，促進滯育準備的完成。

圖6 沉默CbAST-B (A),CbAST-C (B)和CbAST-B+CbAST-C (C)對注定滯育大猿葉蟲4日齡雌成蟲脂肪體中Vg1和Vg2表達以及卵巢發(fā)育(D)的影響Fig.6 Effects of knocking down CbAST-B (A),CbAST-C (B) and CbAST-B+CbAST-C (C) on the expression of Vg1 and Vg2 in the fat body and ovarian development (D) in the diapause-destined 4-day-old female adults of Colaphellus bowringi

3 討論

在具生殖滯育特性的昆蟲中，活化的咽側(cè)體會生成更多的JH來促進昆蟲的產(chǎn)卵并繁殖后代，而抑制其咽側(cè)體的活性來維持較低的JH水平是昆蟲順利進入生殖滯育的先決條件(Denlingeretal.,2012)。在許多昆蟲中發(fā)現(xiàn)，由腦分泌的AT和AST在成蟲CA的活化和JH的合成調(diào)控中扮演了重要的角色(Weaver and Audsley,2009)。AT作為一種重要的昆蟲JH合成生物促進因子，已經(jīng)在煙草天蛾、埃及伊蚊等多種昆蟲中均被成功鑒定(Kataokaetal.,1989;Veenstra and Costes,1999)。ASTs在昆蟲中分化為A,B和C 3個不同的家族，在家蠶和雙斑蟋蟀中可以鑒定到AST-A和AST-B，馬鈴薯甲蟲中鑒定到AST-B和AST-C，而煙草天蛾和黑腹果蠅中可以同時鑒定到3種ASTs的同源基因(Stay and Tobe,2007;Mengetal.,2015)。本研究在大猿葉蟲中鑒定到了一個CbAT和兩個CbAST-B和CbAST-C的同源基因，其氨基酸序列均能在進化樹上與鞘翅目物種聚為一支(圖1)。同時，大猿葉蟲CbAT,CbAST-B和CbAST-C的序列分別具備保守結(jié)構(gòu)域TARGF(Y)G,W(X)6W以及PV(I)SCF以及經(jīng)典的KR位點(圖2)，但與赤擬谷盜同源基因的氨基酸序列一致性卻分別僅為32.6%,52.7%和30.9%。這是由于昆蟲AT和AST作為神經(jīng)肽基因，編碼肽鏈氨基酸數(shù)量較少，因此在物種間序列分化程度較高，這也進一步驗證了其序列上保守的結(jié)構(gòu)與區(qū)段在物種進化過程中的高度保守性。

對于淡色庫蚊、始紅蝽以及大猿葉蟲等具生殖滯育特性的昆蟲而言，JH對雌成蟲卵粒的成熟具有明顯的促進作用，而JH缺乏會導(dǎo)致雌成蟲卵巢發(fā)育停滯并進入生殖滯育(Kangetal.,2014;Smykaletal.,2014;Liuetal.,2016)。但關(guān)于JH合成是如何被促進或抑制的機制一直未能明確，而神經(jīng)肽作為昆蟲生命活動的重要調(diào)節(jié)因子，其在JH合成中的調(diào)控功能被廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，AT可以刺激煙草天蛾CA產(chǎn)生大量的JH，促進雌成蟲卵粒的成熟(Nijhout and Riddiford,1974;Kataokaetal.,1989)，沉默AT基因可導(dǎo)致淡色庫蚊雌成蟲卵巢發(fā)育停滯，引發(fā)生殖向滯育的轉(zhuǎn)變(Kangetal.,2014)，但在大猿葉蟲中，CbAT基因?qū)T導(dǎo)光信號的變化并不敏感，其表達水平在滯育誘導(dǎo)末期到滯育準備期結(jié)束均與生殖個體無顯著的分化(圖3)，據(jù)此推測其對生殖和滯育的決定不起主要作用。然而，CbAST-B和CbAST-C在滯育準備期的表達量均顯著高于產(chǎn)卵前期(圖3)，暗示CbASTs基因可能參與了大猿葉蟲注定滯育個體中JH含量的下調(diào)和滯育準備，隨后的RNAi實驗進一步驗證了這一推測。當(dāng)沉默注定滯育大猿葉蟲的CbAST-B和CbAST-C后，JH合成起始步驟基因AACT以及限速酶基因JHAMT的表達也被顯著上調(diào)(圖5)，這可能是由于沉默CbASTs基因打破了其對CA中檸檬酸從線粒體到細胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運的阻隔作用，促進了JH合成初級底物乙酰-CoA的生成(Nouzovaetal.,2015)，進而有效激活了JH合成及其信號通路，從而進一步促進了下游轉(zhuǎn)錄因子Kr-h1基因以及受JH誘導(dǎo)的JHE1的表達(圖5)。另外，本研究沉默大猿葉蟲CbAST-B和CbAST-C后均能促進脂肪體內(nèi)卵黃原蛋白基因Vg1和Vg2的表達，卻不能逆轉(zhuǎn)雌成蟲卵巢的發(fā)育狀態(tài)(圖6)。這是由于卵巢的發(fā)育是多層次的，包括卵母細胞、濾泡細胞、滋養(yǎng)細胞等的組織器官自身發(fā)育以及卵黃原蛋白的合成及卵母細胞對其的攝取等諸多過程。研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲卵黃原蛋白在脂肪體中合成，并通過囊泡運輸至昆蟲血淋巴，從而被卵母細胞吸收積累與卵巢小管(龔和和翟啟慧,1979)。另外，JH可以促進濾泡細胞膜的開放以及卵黃原蛋白受體(vitellogenin receptor)基因VgR的表達，從而促進卵黃原蛋白的吸收(Davey,1981;Liuetal.,2018)，而大猿葉蟲CbAST-B和CbAST-C通過抑制了JH的合成限制了卵黃原蛋白的生成和吸收，而對于卵巢細胞自身的分化和發(fā)育并沒有明顯的調(diào)控功能。綜上所述，CbAST-B和CbAST-C作為重要的JH合成調(diào)控因子，在長光照誘導(dǎo)的大猿葉蟲滯育準備階段抑制了JH的合成，進而抑制了卵黃的生成、促進了滯育的發(fā)生；而促咽側(cè)體素基因CbAT不在表達水平上響應(yīng)滯育誘導(dǎo)光周期，因此可能不是生殖和滯育轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵調(diào)控因子。本研究進一步揭示了昆蟲生殖滯育準備期保幼激素信號的調(diào)控機制，有助于進一步理解昆蟲對環(huán)境的季節(jié)性適應(yīng)策略，為開發(fā)害蟲防控新靶標(biāo)提供了理論借鑒。