李游山,路慶君,楊 璽,張 杰,羅竹星,夏慶友,趙 萍，*

(1.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,陜西漢中 723001;2.陜西理工大學(xué),陜南秦巴山區(qū)生物資源綜合開(kāi)發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心,陜西漢中 723001;3.西南大學(xué)前沿交叉學(xué)科研究院,生物學(xué)研究中心,重慶 400715)

家蠶Bombyxmori是一種具有重要價(jià)值的絹絲昆蟲(chóng)，也是鱗翅目昆蟲(chóng)的典型代表，具有深厚的基礎(chǔ)研究積淀。有研究報(bào)道，真菌等病原物在入侵宿主過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生豐富的胞外蛋白酶，這些蛋白酶在病原物入侵中發(fā)揮著關(guān)鍵作用(St Leger,1995;Travisetal.,1995)。體壁降解蛋白酶是致病性真菌重要的毒力因子，通常在孢子萌發(fā)時(shí)分泌于宿主體壁，參與宿主表皮的穿透過(guò)程(St Leger,1995;Charnley,2003)。過(guò)表達(dá)這些毒力蛋白酶可以顯著增強(qiáng)致病性真菌的毒力(St Legeretal.,1996;Yangetal.,2005,2011;Zhangetal.,2008)。

盡管昆蟲(chóng)體內(nèi)沒(méi)有類(lèi)似于哺乳動(dòng)物的淋巴細(xì)胞、免疫球蛋白和完整的補(bǔ)體系統(tǒng)，但是昆蟲(chóng)在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成了復(fù)雜的天然免疫系統(tǒng)，其中絲氨酸蛋白酶抑制劑就是在昆蟲(chóng)免疫中發(fā)揮著重要作用。蛋白酶抑制劑可通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)源蛋白酶活性參與昆蟲(chóng)凝血、酚氧化酶激活或細(xì)胞因子激活等過(guò)程(Kanost,1999;Cereniusetal.,2010;Fullaondoetal.,2011)。昆蟲(chóng)還會(huì)響應(yīng)表達(dá)高豐度的蛋白酶抑制劑，用于抑制微生物侵入宿主的毒力蛋白酶的活性，以應(yīng)對(duì)病原微生物的入侵(Fr?biusetal.,2000;Vilcinskas,2010;Lietal.,2016b)。筆者前期的研究對(duì)免疫相關(guān)的家蠶蛋白酶抑制劑進(jìn)行了系統(tǒng)鑒定，發(fā)現(xiàn)多個(gè)TIL(trypsin inhibitor-like cysteine-rich domain)家族蛋白酶抑制劑在微生物添食感染家蠶后上調(diào)表達(dá)，暗示這些蛋白酶抑制劑可能參與家蠶的免疫過(guò)程(Zhaoetal.,2012)。在已發(fā)現(xiàn)的這些TIL家族蛋白酶抑制劑中，BmSPI38和BmSPI39不僅能夠抑制球孢白僵菌產(chǎn)生的體壁降解蛋白酶CDEP-1活性，還可以抑制CDEP-1誘導(dǎo)的有害黑化和白僵菌的分生孢子萌發(fā)，從而增強(qiáng)家蠶的抗真菌能力(Lietal.,2012,2015)。另有研究顯示，以BmSPI39為代表的TIL類(lèi)蛋白酶抑制劑能夠隨家蠶泌絲過(guò)程進(jìn)入繭層中，并通過(guò)抑制病原微生物分泌的毒力蛋白酶活性為繭內(nèi)的蛹提供保護(hù)(Dongetal.,2013;Zhangetal.,2015;Guoetal.,2016;Lietal.,2016b)。家蠶是由野生桑蠶馴化而來(lái)，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的馴化和選育，家蠶繭的重量已達(dá)到野生蠶繭的10倍以上。定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果表明，在野生蠶繭中，包括TIL家族蛋白酶抑制劑BmSPI39在內(nèi)的眾多蛋白酶抑制劑的表達(dá)量都顯著高于家蠶繭(Daietal.,2019)。野生桑蠶、家蠶的絲腺組織的定量PCR和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)果。進(jìn)一步研究證實(shí)野生蠶繭中的微生物蛋白酶抑制劑活性明顯強(qiáng)于家蠶繭，暗示野生蠶繭中高豐度的蛋白酶抑制劑可能在抵御病原物入侵中發(fā)揮著保護(hù)作用，推測(cè)與其生活的較為惡劣的自然環(huán)境有關(guān)(Daietal.,2019)。

蛹是從幼蟲(chóng)到成蟲(chóng)的變態(tài)過(guò)渡階段，也是蠶生命周期中最脆弱的階段，基本上不能對(duì)威脅作出反應(yīng)。迄今為止，人們對(duì)昆蟲(chóng)先天性免疫進(jìn)行了廣泛的研究，但對(duì)蛹期昆蟲(chóng)應(yīng)對(duì)病原物感染的基本策略知之甚少。受限于蛋白檢測(cè)手段，人們對(duì)抗真菌因子BmSPI39在家蠶體內(nèi)生理功能和作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)還十分有限。蛹期家蠶體壁中BmSP39的表達(dá)能否響應(yīng)球孢白僵菌Beauveriabassiana入侵過(guò)程尚不清楚。因此，獲得廉價(jià)、高效、特異的BmSP39抗體對(duì)研究家蠶TIL家族蛋白酶抑制劑體內(nèi)功能尤為重要。本研究擬制備兔抗家蠶BmSPI39的多克隆抗體，并對(duì)球孢白僵菌誘導(dǎo)下的游走期之后家蠶體壁中的BmSPI39的表達(dá)特征進(jìn)行分析，對(duì)深入研究BmSPI39在家蠶體內(nèi)的生理功能和深化對(duì)家蠶蛹期抗真菌機(jī)制的認(rèn)識(shí)有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試生物和抗體

供試家蠶“大造”品系、球孢白僵菌B.bassianaBb1菌株和重組表達(dá)載體BmSPI39-p28均由西南大學(xué)家蠶基因組生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。在自然光照周期下以新鮮桑葉飼養(yǎng)家蠶，飼養(yǎng)溫度為25℃，相對(duì)濕度為75%±5%。成年新西蘭雄兔購(gòu)自重慶辛創(chuàng)生物技術(shù)有限公司。小鼠抗α-tubulin抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)均購(gòu)自碧云天公司。

1.2 BmSPI39的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

BmSPI39蛋白的表達(dá)與純化可參照筆者先期報(bào)道的方法(Lietal.,2015)，略有調(diào)整。將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體BmSPI39-p28轉(zhuǎn)化入大腸桿菌EscherichiacoliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，待OD600=0.6～1.0時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.2 mmol/L，在37℃下繼續(xù)培養(yǎng)5 h。融合表達(dá)的BmSPI39的蛋白N末端連有一個(gè)的多聚組氨酸標(biāo)簽(MGHHHHHHM)。收集菌體，用結(jié)合緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl,500 mmol/L NaCl,pH 7.9)重懸菌體，超聲波破碎后，4℃ 16 000×g離心30 min，分別收集上清和沉淀部分。利用Ni2+-NTA親和層析柱(Merck)純化BmSPI39重組蛋白。最后將純化后的BmSPI39重組蛋白透析至0.9% NaCl溶液中，用作免疫用抗原蛋白。

1.3 BmSPI39重組蛋白膠內(nèi)蛋白酶抑制劑活性染色檢測(cè)

將1.2節(jié)誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白樣品與4×Native PAGE加樣緩沖液(40 mmol/L Tris-HCl，40%甘油，0.032%溴酚藍(lán)，pH 8.0)混合，并利用10% Native PAGE(pH 8.3)對(duì)純化前后不同稀釋度的蛋白樣品進(jìn)行分離。另外，將蛋白樣品與不含還原劑的SDS-PAGE上樣緩沖液混勻后，不進(jìn)行加熱處理，直接利用15% SDS-PAGE進(jìn)行分離。蛋白樣品經(jīng)10% Native PAGE(pH 8.3)或非還原SDS-PAGE分離后，參照筆者先前報(bào)道的方法(Lietal.,2012b)進(jìn)行膠內(nèi)活性染色。將電泳后蛋白膠置于0.07%的枯草桿菌Bacillussubtilis蛋白酶A溶液(0.1 mol/L Tris-HCl,10 mmol/L CaCl2,pH 7.5)中，37℃避光條件下，45 r/min振蕩孵育15 min?；厥盏鞍酌溉芤?，并利用ddH2O清洗膠2次，每次10 s，然后37℃條件下靜置15 min。按照1∶10的體積比加入底物[20 mg N-乙?；?D,L-苯丙氨酸-β-萘酯(N-acetyl-D,L-phenylalanine-β-naphthylester,APNE)溶于10 mL N，N′-二甲基甲酰胺(N,N′-dimethylformamide)]和染色液[100 mg固藍(lán)B鹽(Fast Blue B Salt)溶于100 mL 0.1 mol/L pH 8.0的Tris-HCl緩沖液]的混合溶液，37℃ 45 r/min條件下避光孵育20 min。最后，棄除染色液，加入ddH2O清洗膠面以終止反應(yīng)。染色原理如下：凝膠上的蛋白酶可分解生色底物APNE，生成的β-萘酚通過(guò)重氮偶合反應(yīng)將膠染成紫紅色。膠內(nèi)蛋白酶抑制劑若能抑制相應(yīng)的蛋白酶活性，其所在位置將不會(huì)被染色，而呈現(xiàn)為白色條帶。

1.4 BmSPI39的多克隆抗體制備

購(gòu)買(mǎi)的新西蘭大白兔在本實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房中飼養(yǎng)1周后，通過(guò)耳動(dòng)脈采集少量免疫前血液，室溫靜置1 h，然后置于4℃過(guò)夜，4℃ 4 000 r/min離心10 min分離血清，用作陰性對(duì)照。將1.2節(jié)純化的1 mg BmSPI39重組蛋白與弗氏完全佐劑(BBI)等體積充分混勻乳化，背部皮下多點(diǎn)免疫大白兔。間隔2周后，將500 μg BmSPI39重組蛋白與弗氏不完全佐劑(BBI)等體積混勻乳化后，加強(qiáng)免疫大白兔。10 d之后，再加強(qiáng)免疫一次。7 d之后，從耳緣靜脈采集少量血液，分離血清，檢測(cè)抗血清效價(jià)。待抗血清效價(jià)達(dá)到預(yù)期水平時(shí)，經(jīng)心臟采血，分離血清，置于-80℃冰箱保存。

采用間接ELISA法對(duì)His6-BmSPI39的抗血清進(jìn)行測(cè)定。利用包被液(0.15% Na2CO3,0.293% NaHCO3,pH 9.6)將抗原His6-BmSPI39稀釋至5 ng/mL，以100 μL/孔加入酶標(biāo)板中，4℃包被過(guò)夜。經(jīng)PBST液[0.8% NaCl,0.02% KH2PO4,0.29% Na2HPO4·12H2O,0.02% KCl,0.05%(v/v)Tween-20]洗滌3次后，加入350 μL 1%脫脂奶粉，于37℃封閉2 h。PBST洗滌3次后，加入100 μL倍比稀釋(1∶1 000,1∶2 000,1∶4 000,1∶8 000,1∶16 000,1∶32 000,1∶64 000,1∶128 000)的免疫血清及免疫前血清，37℃孵育1 h，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。接著，依次進(jìn)行洗滌、HRP標(biāo)記的二抗中37℃孵育1 h(1∶2 000,100 μL/孔)、洗滌、TMB顯色液中室溫顯色15 min(100 μL/孔)，最后加入100 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)。采用BioTek Epoch全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定492 nm的吸光值，評(píng)估抗體效價(jià)。

1.5 BmSPI39的多克隆抗體的純化

依次利用硫酸銨分級(jí)沉淀法和HiTrap rProtein A親和層析柱(GE Healthcare)對(duì)1.4節(jié)制備的BmSPI39多克隆抗體進(jìn)行純化。取10 mL血清，加入等體積的0.9% NaCl溶液，再逐滴加入5 mL飽和(NH4)2SO4溶液，使之成為20%的(NH4)2SO4溶液，室溫靜置30 min。3 000 r/min離心20 min，棄去沉淀后，逐滴加入15 mL飽和(NH4)2SO4溶液，使之成為50% (NH4)2SO4溶液，室溫靜置30 min。離心，棄上清。利用10 mL 0.9% NaCl溶液重新溶解沉淀后，逐滴加入5 mL飽和(NH4)2SO4溶液，使之成為33%的(NH4)2SO4溶液，室溫靜置30 min，離心棄上清，重復(fù)此步驟3次。然后，加入5 mL 0.02 mol/L PBS(pH 7.4)重新溶解沉淀，于4℃ PBS(0.02 mol/L,pH 7.4)中透析24 h，每8 h更換一次緩沖液。用PBS平衡HiTrap rProtein A親和層析柱后，取5 mL透析后的多克隆抗體上樣，待PBS漂洗至基線平穩(wěn)后，采用0.1 mol/L檸檬酸三鈉溶液(pH 3.5)進(jìn)行洗脫，并于每毫升洗脫液中加入100 μL 1 mol/L Tris-HCl(pH 9.0)以中和pH值，置于-80℃保存。最后，利用15%的SDS-PAGE和硝酸銀染色對(duì)純化后的多克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的BmSPI39的時(shí)空表達(dá)分析

前期研究顯示，重組BmSPI39能夠抑制球孢白僵菌的孢子萌發(fā)，體表浸潤(rùn)法包被BmSPI39蛋白能夠顯著提高家蠶的抗白僵菌能力(Lietal.,2015)。為了分析BmSPI39在家蠶免疫相關(guān)的組織和器官中的時(shí)空表達(dá)情況，由家蠶開(kāi)放性數(shù)據(jù)庫(kù)SilkDB 3.0(Luetal.,2020)，獲取BmSPI39(Gene ID:BMSK0001557)在4齡第3天至化蛹后1 d家蠶的體壁、中腸和脂肪體中表達(dá)數(shù)據(jù)，并利用Heml1.0軟件進(jìn)行熱圖分析。

1.7 球孢白僵菌體表接觸接種家蠶

球孢白僵菌體表接觸接種家蠶按照筆者前期報(bào)道的方法(李游山等,2018)進(jìn)行。首先，利用滅菌ddH2O配制2×106孢子/mL和2×107孢子/mL的球孢白僵菌分生孢子懸液。然后，將單層無(wú)菌紗布包裹的游走期(即家蠶“熟蠶”期)家蠶幼蟲(chóng)于不同濃度的孢子懸液中浸泡10 s，取出置于塑料盒中的無(wú)菌簇具上，于28℃感染家蠶幼蟲(chóng)體表。就“大造”品系而言，在正常飼養(yǎng)條件下，游走期一般為1～2 d，上蔟吐絲結(jié)束進(jìn)入預(yù)蛹，再經(jīng)1～2 d左右蛹皮形成，進(jìn)入蛹期。ddH2O處理組作為空白對(duì)照。收集接種球孢白僵菌后36 h(吐絲期),60 h(預(yù)蛹期),84 h(化蛹后1 d),108 h(化蛹后2 d)和120 h(化蛹后3 d)的家蠶體壁，液氮中速凍后，置于-80℃保存，用于進(jìn)一步研究家蠶幼蟲(chóng)在上蔟吐絲至化蛹階段BmSPI39蛋白是否在體壁中表達(dá)，其表達(dá)能否響應(yīng)球孢白僵菌入侵。

1.8 Western blot球孢白僵菌侵染后家蠶體壁中BmSPI39的表達(dá)

為了進(jìn)一步研究在上蔟吐絲至化蛹階段BmSPI39蛋白是否在家蠶體壁中表達(dá)，其表達(dá)能否響應(yīng)球孢白僵菌入侵，利用不同濃度的球孢白僵菌接種起始上蔟吐絲的家蠶，并對(duì)接種后不同時(shí)間點(diǎn)(也即幼蟲(chóng)上蔟吐絲起始后的不同時(shí)間點(diǎn))的幼蟲(chóng)和蛹期體壁中的BmSPI39進(jìn)行Western blot分析。采用組織裂解液(8 mol/L尿素，2% CHAPS,0.4% DTT)提取1.7節(jié)中接種球白僵菌后不同時(shí)間點(diǎn)的家蠶體壁蛋白質(zhì)，并利用Bradford法(Bradford,1976)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。蛋白樣品經(jīng)15%的還原性SDS-PAGE分離后，電轉(zhuǎn)印記至PVDF膜上。將膜置于5%脫脂奶粉中，4℃條件下封閉過(guò)夜。使用針對(duì)BmSPI39的多克隆抗體作為第一抗體(1∶2 500)和HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶40 000)作為二抗。以α-tubulin作為內(nèi)參。使用ECL檢測(cè)試劑盒(Roche)顯色，檢測(cè)其化學(xué)發(fā)光信號(hào)。運(yùn)用Quantity One軟件對(duì)Western blot的條帶進(jìn)行灰度分析。首先將目的蛋白條帶的灰度值除以內(nèi)參蛋白條帶的灰度值，進(jìn)行歸一化處理。然后以空白對(duì)照組歸一化后的灰度值為基數(shù)，實(shí)驗(yàn)組歸一化后的灰度值與其比值為相對(duì)灰度值，也即蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 BmSPI39原核表達(dá)

原核表達(dá)結(jié)果表明，在0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h條件下，BmSPI39在BL21(DE3)菌株上清中高量表達(dá)(圖1:A)，經(jīng)鎳柱親和純化后獲得一個(gè)約18 kD的高純度蛋白質(zhì)(圖1:B)，其表觀分子量與BmSPI39重組蛋白的二聚體大小一致。鑒于BmSPI39能夠抑制枯草桿菌蛋白酶等微生物物源的蛋白酶活性(Lietal.,2015)，利用10% Native PAGE(pH 8.3)對(duì)純化前后不同稀釋度的蛋白樣品進(jìn)行分離和進(jìn)行蛋白酶抑制劑膠內(nèi)活性染色檢測(cè)，結(jié)果顯示純化后的重組BmSPI39蛋白能夠強(qiáng)烈抑制枯草桿菌蛋白酶A的活性(圖1:C)，證實(shí)該純化蛋白為有生物學(xué)活性的His6-BmSPI39重組蛋白。

圖1 家蠶BmSPI39的重組表達(dá) (A)、純化(B)及其對(duì)枯草桿菌蛋白酶A的膠內(nèi)活性染色檢測(cè)(C)Fig.1 Expression (A),purification (B) of the recombinant BmSPI39 of Bombyx mori and its activity to the subtilisin A detected by in-gel activity staining (C)CK-S和CK-U分別表示對(duì)照組的菌體上清和不可溶成分；IPTG-S和IPTG-U分別表示IPTG誘導(dǎo)組中的菌體上清和不可溶成分。His6- BmSPI39表示含組氨酸標(biāo)簽的BmSPI39重組蛋白；箭頭所示為BmSPI39重組蛋白條帶及其活性染色帶；C圖中白色條表示帶膠內(nèi)BmSPI39具有能抑制枯草桿菌蛋白酶A的蛋白酶活性。CK-S and CK-U indicate the supernatant and insoluble components of the E.coli cells in the control group,respectively.IPTG-S and IPTG-U indicate the supernatant and insoluble components of the IPTG-induced E.coli cells,respectively.His6-BmSPI39 denotes the hexahistidine-tagged recombinant BmSPI39.The arrowheads show the protein bands and activity-stained bands of the recombinant BmSPI39.The white band in figure C indicates that BmSPI39 in the gel can inhibit the protease activity of subtilisin A.下同The same below.

2.2 BmSPI39多克隆抗體的制備、純化及Western blot分析

間接ELISA法測(cè)定結(jié)果表明，BmSPI39抗血清的效價(jià)達(dá)1∶128 000(圖2:A)。親和層析結(jié)果顯示，在多克隆抗體的洗脫峰出現(xiàn)在洗脫體積30～35 mL之間，且峰值較高(圖2:B)。SDS-PAGE結(jié)果顯示，在表觀分子質(zhì)量約55和28 kD處檢測(cè)到清晰的抗體重鏈和輕鏈條帶(圖2:C)，獲得了較高純度的BmSPI39多克隆抗體。

Western blot結(jié)果顯示，在BmSPI39重組蛋白二聚體和三聚體分子量大小處皆出現(xiàn)清晰的蛋白條帶，且BmSPI39重組蛋白主要以二聚體形式存在，少量以三聚體形式存在(圖3:D)。為排除樣品中雜蛋白非特異結(jié)合對(duì)Western blot結(jié)果的干擾，我們利用非還原SDS-PAGE對(duì)BmSPI39重組蛋白進(jìn)行分離后，采用膠內(nèi)活性染色法檢測(cè)其對(duì)枯草桿菌蛋白酶的抑制活性。結(jié)果顯示，IPTG誘導(dǎo)后的菌體上清中只檢測(cè)到BmSPI39蛋白的二聚體的活性條帶，純化后的BmSPI39重組蛋白中除檢測(cè)到很強(qiáng)的二聚體活性條帶外，還能檢測(cè)到微弱的三聚體活性條帶(圖2:E)。上述結(jié)果表明，制備的多克隆抗體能夠識(shí)別BmSPI39重組蛋白的各種形式，可用于BmSPI39生理功能的相關(guān)研究。

2.3 基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的BmSPI39的時(shí)空表達(dá)分析

基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的BmSPI39時(shí)空表達(dá)熱圖分析表明，BmSPI39在游走期和預(yù)蛹期的家蠶體壁中皆有表達(dá)，但在4齡第3天-5齡第3天之間及化蛹第1天的家蠶體壁中都不表達(dá)；BmSPI39在預(yù)蛹期的脂肪體中的表達(dá)量較高，但在各時(shí)期的中腸中均未檢測(cè)到表達(dá)(圖3)。

圖2 家蠶BmSPI39多克隆抗體的純化及Western blot分析Fig.2 Purification and Western blot analysis of anti-BmSPI39 polyclonal antibody of Bombyx moriA:BmSPI39抗血清的效價(jià)測(cè)定Titer determination of BmSPI39 antiserum;B:BmSPI39多克隆抗體的親和純化Affinity purification of anti-BmSPI39 polyclonal antibody;C:純化的BmSPI39多克隆抗體的SDS-PAGE分析SDS-PAGE analysis of the purified anti-BmSPI39 polyclonal antibody;D:基于Western blot技術(shù)的純化的BmSPI39多克隆抗體的抗原結(jié)合特性分析Analysis of antigen-binding properties of the purified anti-BmSPI39 polyclonal antibody by Western blot;E:經(jīng)非還原SDS-PAGE分離后BmSPI39重組蛋白的膠內(nèi)活性分析In-gel activity analysis of BmSPI39 recombinant protein after separation by non-reducing SDS-PAGE.Trimer:三聚體;Dimer:二聚體.FT&WF:流穿和漂洗部分Flow-through and washing fractions;EF:洗脫部分Elution fraction.

圖3 基于家蠶開(kāi)放性數(shù)據(jù)庫(kù)SilkDB 3.0利用Heml1.0對(duì)BmSPI39在家蠶免疫相關(guān)的組織中的時(shí)空表達(dá)熱圖分析Fig.3 Heat map analysis of the spatiotemporal expression of BmSPI39 gene in immune-related tissues of Bombyx mori based on the open database SilkDB 3.0 using Heml 1.0

2.4 球孢白僵菌感染后家蠶體壁中BmSPI39蛋白的表達(dá)特征

接種后不同時(shí)間點(diǎn)幼蟲(chóng)體壁中BmSPI39 的Western blot分析結(jié)果表明，接種白僵菌后36 h(吐絲期)和60 h(預(yù)蛹期)，對(duì)照組及2×106和 2×107孢子/mL孢子懸浮液處理組中的家蠶體壁中皆未檢測(cè)到BmSPI39的表達(dá)(圖4:A,D);接種后84 h(化蛹第1天)，BmSPI39的蛋白前體以同源四聚體和三聚體的形式表達(dá)于家蠶體壁中(圖4:B)，隨著家蠶的發(fā)育進(jìn)程其N(xiāo)端信號(hào)肽被切除，形成成熟體蛋白的同源四聚體和三聚體(圖4:B,C)。與對(duì)照組相比，2×106和 2×107孢子/mL分生孢子孢子懸浮液接種家蠶后84 h時(shí)BmSPI39的表達(dá)量分別上調(diào)至2.29和1.45倍，108 h(化蛹第2天)時(shí)的表達(dá)量分別下調(diào)至0.39和0.54倍(圖4:E)。2×107孢子/mL分生孢子孢子懸浮液接種家蠶后120 h(化蛹第3天)時(shí)BmSPI39的表達(dá)量進(jìn)一步下調(diào)至對(duì)照組的0.10倍(圖4:F)。上述結(jié)果提示，家蠶體壁中的BmSPI39蛋白的表達(dá)能夠響應(yīng)球孢白僵菌的入侵過(guò)程，且在接種后84 h(化蛹第1天)表達(dá)響應(yīng)至高峰，后下調(diào)低于未接種球孢白僵菌的對(duì)照組。

圖4 Western blot檢測(cè)感染孢白僵菌不同時(shí)間后家蠶幼蟲(chóng)和蛹體壁中BmSPI39的表達(dá)量Fig.4 Expression levels of BmSPI39 in the integument of Bombyx mori larvae and pupae at different time after infection of Beauveria bassiana detected by Western blot幼蟲(chóng)感染后時(shí)間Time post infection to larvae:A,D:36,60 h;B,E:84,108 h;C,F:120 h.α-tubulin:內(nèi)參蛋白R(shí)eference protein;CK:空白對(duì)照組Blank control group;Bb1,Bb2:分別表示2×106和2×107孢子/mL分生孢子懸浮液處理組Groups treated with 2×106 and 2×107 conidia/mL of conidial suspension,respectively;Tr:蛋白三聚體Trimeric protein;Te:蛋白四聚體Tetrameric protein.Tr*:成熟體蛋白三聚體Trimeric mature protein;Te*:成熟體蛋白四聚體Tetrameric mature protein.圖D,E,F分別為圖A,B,C的相對(duì)表達(dá)量分析。Figures D,E and F are the relative expression level analysis of figures A,B and C,respectively.

3 討論

本研究成功制備了家蠶中TIL家族蛋白酶抑制劑BmSPI39的多克隆抗體，并基于該抗體蛋白發(fā)現(xiàn)家蠶體壁中的BmSPI39蛋白的表達(dá)能夠響應(yīng)球孢白僵菌的入侵。

鎳柱親和純化后的BmSPI39重組蛋白經(jīng)還原性SDS-PAGE分離后，在相對(duì)分子質(zhì)量約為18 kD的位置出現(xiàn)一條豐度較高的單一條帶，其表觀分子量與BmSPI39重組蛋白的二聚體大小一致(圖1:B)。然而，純化后的蛋白有3條活性抑制活性帶，提示有多種活性存在形式(圖1:C)，這與我們前期的研究報(bào)道一致。我們的前期研究表明，家蠶TIL家族的BmSPI38和BmSPI39重組蛋白非還原條件下都傾向形成多聚體(Lietal.,2016a)，且多聚體化對(duì)這兩個(gè)抑制劑的活性至關(guān)重要(Lietal.,2018)。在還原劑和SDS存在條件下，BmSPI39重組蛋白的四聚體可轉(zhuǎn)換為更加穩(wěn)定的二聚體形式，其三聚體含量又低于考馬斯亮藍(lán)染色的檢測(cè)下限，因此在SDS-PAGE分析中只檢測(cè)到一條均一的二聚體條帶。截止目前文獻(xiàn)報(bào)道，這種多聚體化現(xiàn)象在典型TIL家族蛋白酶抑制劑中未見(jiàn)報(bào)道。Western blot分析和非還原SDS-PAGE分離后的膠內(nèi)活性染色結(jié)果表明(圖2:D,E)，純化的BmSPI39重組蛋白主要以二聚體形式存在，少量以三聚體形式存在，制備的多克隆抗體能夠有效結(jié)合各種多聚體化狀態(tài)下的BmSPI39蛋白，可用于BmSPI39的檢測(cè)。需要指出的是，重組BmSPI39蛋白經(jīng)非還原SDS-PAGE電泳分離后仍能保持活性可能與其特殊的高級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)。三維結(jié)構(gòu)建模顯示，BmSPI39中只含有2個(gè)反平行的β折疊片以及一個(gè)小α螺旋，其余區(qū)域都是柔性的loop區(qū)域。其TIL結(jié)構(gòu)域中含有4對(duì)二硫鍵(Cys29-Cys62,Cys40-Cys54,Cys44-Cys92和Cys64-Cys76)，這4對(duì)二硫鍵維持著蛋白剛性結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，使大片的柔性loop區(qū)域形成一個(gè)相對(duì)緊湊而又具有一定柔性的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)(Lietal.,2016a)。因而，在SDS存在下仍能保持生物學(xué)活性。

體壁是蠶體最外的組織，在防止病原體入侵中發(fā)揮著重要作用。脂肪體是重要的中間代謝組織，也是抗菌肽合成的重要場(chǎng)所。有研究顯示，BmSPI39在5齡第5天家蠶幼蟲(chóng)的前中部絲腺中高量特異表達(dá)，但在體壁和脂肪體中不表達(dá)(Lietal.,2016b)。為分析抗真菌因子BmSPI39是否在家蠶體壁和脂肪體中表達(dá)，基于SilkDB 3.0轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，我們對(duì)BmSPI39在家蠶免疫相關(guān)組織中的表達(dá)特征進(jìn)行分析。結(jié)果顯示BmSPI39在游走期和預(yù)蛹期的體壁及預(yù)蛹期的脂肪體中轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而于上蔟前的家蠶幼蟲(chóng)體壁和脂肪體中不表達(dá)(圖3)。

家蠶中有很多TIL家族的蛋白酶抑制劑參與家蠶對(duì)真菌入侵的免疫應(yīng)答。我們前期運(yùn)用基因芯片、半定量RT-PCR、qPCR等技術(shù)對(duì)添食感染球孢白僵菌后的家蠶幼蟲(chóng)中的蛋白酶抑制劑基因表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BmSPI37(BGIBMGA009073),BmSPI38(BGIBMGA009094),BmSPI39(BGIBMGA009092),BmSPI46(BGIBMGA004727),BmSPI48(BGIBMGA010892)等TIL家族蛋白酶抑制劑基因顯著上調(diào)表達(dá)(李游山等,2012;Zhaoetal.,2012)。邢東旭等利用體表接觸感染法接種“抗8”品系家蠶5齡第1天幼蟲(chóng)，并采用RNA-Seq對(duì)接種球孢白僵菌后96 h的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，接種白僵菌的家蠶幼蟲(chóng)中的BmSPI38,BmSPI39和BmSPI41(BGIBMGA009073)基因表達(dá)量顯著上調(diào)(Xingetal.,2017)。非標(biāo)定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，接種球孢白僵菌36 h后的5齡幼蟲(chóng)中的BmSPI35(GenBank登錄:XP_004924403)和BmSPI36(GenBank登錄:XP_004924401)皆下調(diào)表達(dá)(Luetal.,2019)。這些結(jié)果顯示，包括BmSPI39在內(nèi)的多個(gè)TIL家族的蛋白酶抑制劑對(duì)家蠶幼蟲(chóng)不同時(shí)期接種的球孢白僵菌都有一個(gè)顯著上調(diào)表達(dá)的響應(yīng)，后表達(dá)響應(yīng)下調(diào)，即存在一個(gè)對(duì)病原真菌入侵刺激的響應(yīng)表達(dá)高峰。本研究Western blot檢測(cè)結(jié)果(圖4)也表明，對(duì)家蠶5齡末的游走期幼蟲(chóng)(即上蔟吐絲期幼蟲(chóng))接種球孢白僵菌后，幼蟲(chóng)體壁中的BmSPI39表達(dá)響應(yīng)高峰在接種后84 h(化蛹第1天)，后表達(dá)響應(yīng)下調(diào)，進(jìn)一步證實(shí)了家蠶BmSPI39響應(yīng)病原真菌入侵的表達(dá)特征。

筆者前期研究中利用不同濃度的球孢白僵菌接種剛進(jìn)入游走期的家蠶幼蟲(chóng)(即起始上蔟吐絲的家蠶幼蟲(chóng))，并對(duì)接種后不同時(shí)間點(diǎn)的幼蟲(chóng)血淋巴中的蛋白酶抑制劑的活性表達(dá)特征進(jìn)行分析。膠內(nèi)活性染色結(jié)果顯示，家蠶蛹期血淋巴中存在一種真菌誘導(dǎo)型蛋白酶抑制劑SI-3，該抑制劑僅在球孢白僵菌接種組表達(dá)，且在接種后84 h(化蛹第1天)、108 h(化蛹第2天)和120 h(化蛹第3天)時(shí)表現(xiàn)出對(duì)枯草桿菌蛋白酶的抑制活性，其活性高峰在接種后84 h(李游山等,2018)。本研究發(fā)現(xiàn)，BmSPI39蛋白也在接種白僵菌后84 h(化蛹第1天)、108 h(化蛹第2天)和120 h(化蛹第3天)時(shí)的家蠶中表達(dá)，其表達(dá)響應(yīng)高峰也出現(xiàn)在接種白僵菌后84 h(圖4)。鑒于BmSPI39與SI-3都能抑制劑枯草桿菌蛋白酶A活性，且對(duì)響應(yīng)白僵菌入侵的表達(dá)特征基本一致，不排除它們?yōu)橥环N蛋白的可能性。由于膠內(nèi)活性染色法的局限性和血淋巴中蛋白的復(fù)雜性，尚無(wú)法通過(guò)質(zhì)譜鑒定等方法對(duì)SI-3蛋白進(jìn)行鑒定。本研究?jī)H對(duì)上蔟后家蠶體壁中的BmSPI39蛋白對(duì)白僵菌入侵的響應(yīng)表達(dá)進(jìn)行了分析，BmSPI39蛋白在蛹期家蠶中的抗真菌機(jī)制尚需進(jìn)一步探究。