張玉明,邵夢華,李亞靜,馮 琴,魏麗亞,*,柳峰松,*

(1.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河北保定 071002;2.河北大學(xué)生命科學(xué)與綠色發(fā)展研究院,河北保定 071002)

線粒體是細(xì)胞進(jìn)行氧化磷酸化的場所，是細(xì)胞的能量和代謝調(diào)控中心。同時(shí)，氧化呼吸代謝旺盛的線粒體也是細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)自由基生成的主要場所(Chakrabartyetal.,2018)。DNA分子中鳥嘌呤對(duì)ROS特別敏感，易受到氧化損傷而轉(zhuǎn)化為8-羥基鳥嘌呤(8-oxoguanine,8-oxoG)。8-羥基鳥嘌呤與胞嘧啶和腺嘌呤均可配對(duì)結(jié)合，會(huì)使DNA發(fā)生G:C到T:A的顛換突變，可能導(dǎo)致多種嚴(yán)重的疾病(Vlahopoulosetal.,2019)。因此，8-羥基鳥嘌呤是一種公認(rèn)的DNA氧化損傷的標(biāo)志物(Ba and Boldogh,2018)。線粒體DNA (mtDNA)結(jié)構(gòu)中沒有組蛋白結(jié)合，裸露存在于線粒體基質(zhì)中，比核基因組更易受ROS攻擊破壞。有報(bào)道稱，8-羥基鳥嘌呤在線粒體中的濃度可達(dá)到細(xì)胞核中3～16倍(Radyuketal.,2006)。

大腸桿菌Escherichiacoli中DNA糖苷酶MutM是最早發(fā)現(xiàn)具有切除8-羥基鳥嘌呤的酶(Michaelsetal.,1991)。隨后，研究證實(shí)釀酒酵母Saccaromycescerevisiae中8-羥基鳥嘌呤糖苷酶1(8-hydroxyguanine glycosylase 1,OGG1,EC 3.2.2.23)也具有相同功能(Nashetal.,1996;Sandigurskyetal.,1997)。然后，堿基剪切修復(fù)(base excision repair,BER)機(jī)制和OGG1功能才開始在哺乳動(dòng)物中得到普遍關(guān)注，證實(shí)了OGG1對(duì)于mtDNA和核基因組DNA均具有重要的保護(hù)作用。OGG1酶兼具DNA糖基化酶和脫嘌呤/嘧啶(apurinic/apyrimidinic,AP)裂解酶的活性，可特異性識(shí)別和切除8-羥基鳥嘌呤，從而恢復(fù)基因組中正常的G:C配對(duì)(陳黎媛等,2014)。在昆蟲中，黑腹果蠅Drosophilamelanogaster的ogg1研究最為深入，研究內(nèi)容涉及基因克隆、結(jié)構(gòu)分析和功能驗(yàn)證(Dherinetal.,2000;Yasukawaetal.,2015;Okumuraetal.,2019)。

家蠅Muscadomestica是一種分布廣泛的雙翅目昆蟲，具有生活周期短、繁殖能力強(qiáng)和易于飼養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)(劉鍵柏等,2020)。研究者所在實(shí)驗(yàn)室對(duì)家蠅中參與氧化應(yīng)激和免疫調(diào)控的多種基因進(jìn)行了功能鑒定，已經(jīng)將家蠅開發(fā)為研究氧化應(yīng)激、先天性免疫和線粒體功能的理想模型生物(顧冀海等,2017;藺冬冬等,2019;Zhangetal.,2020)。前期研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌刺激后的家蠅轉(zhuǎn)錄組中ogg1基因(Mdogg1)顯著上調(diào)(Tangetal.,2014)，暗示該基因在家蠅中具有參與氧化應(yīng)激調(diào)控的功能。本研究旨在克隆鑒定家蠅Mdogg1基因，驗(yàn)證其參與氧化應(yīng)激調(diào)控的功能作用。

1 材料與方法

1.1 試蟲來源及飼養(yǎng)

家蠅種蠅為中國科學(xué)院動(dòng)物研究所何鳳琴老師惠贈(zèng)，已由本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)繁殖多代。飼養(yǎng)條件為：溫度25℃，相對(duì)濕度50%～70%，光周期12L∶12D。家蠅幼蟲飼料由70 g麩皮和100 mL水組成；家蠅成蟲飼料為0.5 g白糖，1 g奶粉和10 mL水。

1.2 Mdogg1的克隆和原核表達(dá)

用RNAiso Plus試劑[大連寶生物(TaKaRa)有限公司]提取5頭家蠅幼蟲總RNA。提取獲得的RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，并利用核酸定量儀測定其濃度和純度后，以2 μg總RNA為模版，用Oligo (dT)18為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室家蠅轉(zhuǎn)錄組中序列信息(Tangetal.,2014)，設(shè)計(jì)Mdogg1基因開放閱讀框(ORF)擴(kuò)增引物Ogg-F1(5′-ATGCTTTCAGTTTCATTCAAGT-3′)和Ogg-R1(5′-TCACTTCTTTCGTTTCTTGTTG-3′)。以獲得的家蠅cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(25 μL):cDNA模板(300 ng/μL) 1 μL,正反向引物(10 mmol/L)各1 μL,Taq PCR Master Mix 12.5 μL,ddH2O 9.5 μL。PCR條件:94℃預(yù)變性4 min;94℃變性30 s,58℃退火40 s,72℃延伸1 min,30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離純化后連接pMD18-T載體，重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌EscherichiacoliDH5α宿主菌。PCR篩選陽性克隆后，測序驗(yàn)證。

1.3 家蠅Mdogg1的生物信息學(xué)分析

使用ExPASy-Protparam (https:∥web.expasy.org/protparam/)預(yù)測蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)；使用NCBI-CDD (https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)和SMART (http:∥smart.embl-heidelberg.de)數(shù)據(jù)庫分析蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域；利用NCBI數(shù)據(jù)庫中BLASTp程序分析蛋白質(zhì)序列相似性，使用Clustal W (http:∥www.clustal.org/clustal2/) 軟件進(jìn)行多重比對(duì)，并利用MEGA軟件(http:∥www.megasoftware.net/)構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹，然后使用ITOL網(wǎng)站(https:∥itol.embl.de/tree/)進(jìn)行作圖分析。

1.4 家蠅不同發(fā)育階段和幼蟲組織中Mdogg1的表達(dá)水平分析

取家蠅卵、1齡和2齡幼蟲各15頭以及3齡幼蟲、蛹和成蟲各3頭為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。收集120頭家蠅3齡幼蟲血細(xì)胞以及5頭3齡幼蟲肌肉、腸道和脂肪體為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。采用1.2的方法合成cDNA，根據(jù)家蠅Mdogg1基因序列設(shè)計(jì)qRT-PCR定量引物Ogg-F2(5′-TCAACAAAACTAAAGGCGG-3′)和Ogg-R2(5′-AAGGACTCAAGGGACGGAA-3′)，檢測Mdogg1在家蠅不同發(fā)育時(shí)期和3齡幼蟲不同組織中的表達(dá)量。以家蠅組成型表達(dá)的β-actin基因作為內(nèi)參基因，其正向引物actin-F(5′-GAGAAATCCTATGAA CTTCCCGACG-3′)和反向引物actin-R(5′-GGATA CCGCAAGATTCCATACCCAA-3′)。qRT-PCR反應(yīng)體系(25 μL):cDNA(300 ng/μL) 2.5 μL，正反向引物(10 mmol/L)各1.25 μL,2×SYBR Premix Ex Taq 12.5 μL,ddH2O 7.5 μL。qRT-PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性1 min;95℃變性20 s,60℃退火10 s,40次循環(huán)。目的基因相對(duì)定量用公式2-ΔΔCT計(jì)算(Livak and Schmittgen,2001)。

1.5 脅迫刺激后家蠅Mdogg1的表達(dá)水平分析

參照Tang等(2019)描述的方法，選取2.5,5,10,20,40,60,80和100 mmol/L的CdCl2水溶液替代家蠅幼蟲培養(yǎng)基中的水與麩皮混勻，投喂2齡家蠅幼蟲進(jìn)行持續(xù)脅迫處理24 h，以未經(jīng)CdCl2處理的家蠅2齡幼蟲為對(duì)照組，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均設(shè)置3組平行實(shí)驗(yàn)，每組處理30頭家蠅幼蟲，取樣檢測Mdogg1表達(dá)水平，同時(shí)使用基于酶聯(lián)免疫吸附法的8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶檢測試劑盒(上海羽朵生物技術(shù)有限公司,產(chǎn)品編號(hào)001)測定8-羥基鳥嘌呤含量。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果(Fengetal.,2020)，使用0.1 g/L的鹽酸阿霉素(doxorubicin hydrochloride,DOX)溶液浸泡30頭家蠅2齡幼蟲30 min，然后恢復(fù)培養(yǎng)6,12和24 h后檢測Mdogg1基因的表達(dá)水平，以未經(jīng)DOX處理的家蠅2齡幼蟲為對(duì)照組。將30頭家蠅2齡幼蟲置于紫外燈(波長280～315 nm，強(qiáng)度5 J/cm2)下分別照射5,10,20和30 min進(jìn)行紫外線(ultraviolet,UV)脅迫，然后取樣檢測Mdogg1基因的表達(dá)水平，以未經(jīng)紫外線處理的家蠅2齡幼蟲為對(duì)照組。上述脅迫刺激實(shí)驗(yàn)的生物學(xué)重復(fù)和技術(shù)重復(fù)均為3次，利用qRT-PCR分析各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中家蠅幼蟲Mdogg1基因表達(dá)情況，qRT-PCR的反應(yīng)體系與條件與1.4節(jié)中相同。

1.6 RNAi干擾Mdogg1后家蠅體內(nèi)Mdogg1表達(dá)水平和氧化還原指標(biāo)測定

按照顧冀海等(2017)報(bào)道的方法，制備Mdogg1基因dsRNA，首先根據(jù)Mdogg1序列信息設(shè)計(jì)干擾引物dsOgg-F(5′-CCCAAGCTTAGAGGAAGC AACGATGCCAAT-3′)和dsOgg-R(5′-CCGCTCGAG ACTCAAGGGACGGAAATGTGT-3′)，以1.2節(jié)合成的家蠅2 齡幼蟲cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件與方法1.2節(jié)相同。將獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)切膠回收、酶切后連接L4440載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆并測序驗(yàn)證，得到L4440-Mdogg1干擾載體，提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌HT115感受態(tài)細(xì)胞，誘導(dǎo)dsRNA表達(dá)，純化dsRNA并測定其濃度。同時(shí)設(shè)計(jì)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP) dsRNA引物dsGFP-F(5′-CCGGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3′)和dsGFP-R(5′-CCGCTCGAGTTACTTGTACAGCTCG TCCATG-3′)，以dsGFP作為對(duì)照。通過顯微注射分別將0.5 ng dsMdogg1和dsGFP注射到家蠅2齡幼蟲體內(nèi)。

將RNAi處理24 h的家蠅2齡幼蟲取樣。各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中家蠅幼蟲Mdogg1基因表達(dá)水平的檢測方法、qRT-PCR的反應(yīng)體系和條件與1.4節(jié)中描述相同。并且，按照Zhang等(2020)描述的方法提取家蠅2齡幼蟲總蛋白，采用Bradford法(Bradford,1976)測定蛋白濃度。使用丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒(南京建城生物工程研究所，貨號(hào)A003-1-2)測定MDA含量，使用活性氧檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號(hào)S0033)測定ROS水平，使用總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)測定試劑盒(南京建城生物工程研究所，產(chǎn)品編號(hào)A001-3-2)測定SOD活性，使用基于酶聯(lián)免疫吸附法的8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶檢測試劑盒(上海羽朵生物技術(shù)有限公司,產(chǎn)品編號(hào)001)測定8-羥基鳥嘌呤含量。各生化指標(biāo)測定實(shí)驗(yàn)的生物學(xué)重復(fù)和技術(shù)重復(fù)均為3次，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)使用15頭家蠅2齡幼蟲。

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)分析使用Excel和SPSS 20.0軟件程序進(jìn)行，數(shù)據(jù)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。實(shí)驗(yàn)組超過2組時(shí)，使用one-way ANOVA方法進(jìn)行分析處理，并運(yùn)用Turkey氏顯著性檢測方法進(jìn)行多重比較；2組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析時(shí)，使用Student氏t檢驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1 Mdogg1基因的克隆與序列分析

克隆得到家蠅Mdogg1基因序列(GenBank登錄號(hào):AYK27449.1)，cDNA長1 062 bp，編碼353個(gè)氨基酸殘基，該蛋白的理論分子量和等電點(diǎn)分別為41.08 kD和9.02。MdOGG1與4種模式生物(人Homosapiens，小鼠Musmusculus，黑腹果蠅Drosophilamelanogaster，斑馬魚Daniorerio)OGG1氨基酸序列一致性分別為38.41%,38.72%,49.02%和36.08%。保守結(jié)構(gòu)域分析顯示(圖1)，盡管MdOGG1與其他模式生物的OGG1蛋白質(zhì)的氨基酸序列相似性不高，但5種OGG1二級(jí)結(jié)構(gòu)保守，分子中均含有螺旋-發(fā)夾-螺旋(Helix-hairpin-Helix,HhH)基序和核酸內(nèi)切酶Ⅲ(endonuclease III)保守結(jié)構(gòu)域ENDO3c。從GenBank數(shù)據(jù)庫中選取膜翅目、鱗翅目、半翅目、鞘翅目和雙翅目昆蟲OGG1氨基酸序列進(jìn)行分子進(jìn)化分析，結(jié)果表明這些OGG1家族成員嚴(yán)格地聚為5個(gè)類群(圖2)，與物種的進(jìn)化關(guān)系高度吻合。

圖1 家蠅與幾種模式生物的OGG1氨基酸序列比對(duì)Fig.1 Alignment of amino acid sequences of OGG1 from Musca domestica and other model species蛋白質(zhì)來源物種及GenBank登錄號(hào)Origin species of proteins and their GenBank accession numbers:MdOGG1:家蠅Musca domestica,AYK27449.1;HsOGG1:人Homo sapiens,NP_001341580.1;MmOGG1:小鼠Mus musculus,NP_035087.3;DmOGG1:黑腹果蠅Drosophila melanogaster,NP_572499.2;DrOGG1:斑馬魚Danio rerio,NP_001116780.1.HhH基序在框中標(biāo)出，下劃線標(biāo)識(shí)的字母是ENDO3c結(jié)構(gòu)域。Sequence of the HhH motif is marked in the box，and the ENDO3c domain is marked with underline.

圖2 鄰接法構(gòu)建的基于氨基酸序列的OGG1系統(tǒng)進(jìn)化樹(1 000次重復(fù))Fig.2 Phylogenetic tree of OGG1 constructed by using neighbor-joining method based on amino acid sequences (1 000 replicates)

2.2 Mdogg1在家蠅不同發(fā)育階段和3齡幼蟲組織中的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示(圖3)，Mdogg1在家蠅卵中表達(dá)量最高，達(dá)到其他發(fā)育階段的10倍以上(P<0.05)。Mdogg1基因在家蠅1齡幼蟲到成蠅的發(fā)育過程中表達(dá)量呈現(xiàn)逐步上升趨勢，蛹和成蟲階段顯著高于幼蟲階段(P<0.05)。對(duì)家蠅3齡幼蟲不同組織中Mdogg1的表達(dá)量分析顯示，Mdogg1在脂肪體中表達(dá)量最高，血細(xì)胞、肌肉和腸道中表達(dá)量顯著較低(P<0.05)。

2.3 脅迫刺激后家蠅2齡幼蟲中Mdogg1的表達(dá)水平及8-羥基鳥嘌呤含量變化

圖3 Mdogg1在家蠅不同發(fā)育階段(A)和3齡幼蟲組織(B)中的相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Relative expression levels of Mdogg1 in different developmental stages (A) and tissues of the 3rd instar larvae (B) of Musca domesticaE:卵Egg;L1-3:分別為1-3齡幼蟲1st-3rd instar larva,respectively;P:蛹Pupa;Ad:成蟲Adult;M:肌肉Muscle;F:脂肪體Fat body;G:腸道Gut;H:血細(xì)胞Hemocyte.不同發(fā)育時(shí)期的基因表達(dá)量使用卵的表達(dá)量進(jìn)行均一化處理；不同組織中的表達(dá)量使用肌肉中的表達(dá)量進(jìn)行均一化處理。圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；柱上不同字母表示不同發(fā)育階段或組織間基因表達(dá)量存在顯著性差異(P<0.05,one-way ANOVA，Turkey氏多重比較)。The expression levels of Mdogg1 in different developmental stages were normalized to that in the egg.The expression levels of Mdogg1 in different tissues were normalized to that in the muscles.Data in the figure are mean±SD.Different letters above bars indicate significant differences in the expression level between different developmental stages and tissues (P<0.05,one-way ANOVA,Turkey’s multiple comparison).

圖4 CdCl2脅迫24 h后家蠅2齡幼蟲體內(nèi)的Mdogg1表達(dá)量(A)和8-羥基鳥嘌呤含量(B)Fig.4 Expression levels of Mdogg1 (A) and 8-oxoG contents (B) in the 2nd instar larvae of Musca domestica after exposure to CdCl2 for 24 hCK:H2O.圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;柱上星號(hào)和雙星號(hào)分別表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)和差異極顯著(P<0.01)(Student氏t檢驗(yàn))。Data in the figure are mean±SD.Asterisk and double asterisk above bars denote significant difference (P<0.05) and extremely significant difference (P<0.01) (Student’s t-test),respectively,from the control group.圖5-6同The same for Figs.5 and 6.

如圖4(A)所示，在2.5～100 mmol/L CdCl2脅迫下，家蠅2齡幼蟲Mdogg1基因表達(dá)量隨著CdCl2濃度的升高呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢。當(dāng)CdCl2濃度為20 mmol/L時(shí)，Mdogg1基因的表達(dá)量達(dá)到最大。當(dāng)CdCl2濃度從20 mmol/L提高到100 mmol/L，Mdogg1基因的表達(dá)量出現(xiàn)逐步回落的現(xiàn)象，但其表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。同時(shí)，家蠅幼蟲體內(nèi)DNA損傷標(biāo)志物8-羥基鳥嘌呤含量隨著CdCl2濃度的提高逐漸增加，尤其是當(dāng)CdCl2濃度超過10 mmol/L時(shí)，8-羥基鳥嘌呤含量上升更為迅速，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(圖4:B)。

家蠅2齡幼蟲浸泡于0.1 g/L DOX 30 min，并恢復(fù)培養(yǎng)12和24 h后Mdogg1的表達(dá)量較未處理對(duì)照顯著升高(P<0.05) (圖5:A)。家蠅幼蟲中Mdogg1的表達(dá)量隨著UV處理時(shí)間的延長而升高(圖5:B)，其中，紫外線照射30 min時(shí)Mdogg1表達(dá)量較未處理對(duì)照呈現(xiàn)極顯著增高(P<0.01)。

2.4 敲低Mdogg1對(duì)家蠅2齡幼蟲體內(nèi)氧化還原狀態(tài)的影響

dsMdogg1注射家蠅 2齡幼蟲處理24 h后，實(shí)驗(yàn)組家蠅幼蟲中Mdogg1的表達(dá)量顯著低于注射dsGFP的對(duì)照組(P<0.05) (圖6:A)。Mdogg1敲低表達(dá)后，家蠅幼蟲中DNA損傷標(biāo)志物8-羥基鳥嘌呤含量較對(duì)照組顯著增高(P<0.05) (圖6:B)，氧化應(yīng)激標(biāo)志物ROS水平和MDA含量顯著升高(P<0.05)(圖6:C,D)。同時(shí)，家蠅幼蟲體內(nèi)SOD酶活性極顯著降低(P<0.01) (圖6:E)。結(jié)果說明，Mdogg1基因表達(dá)水平敲低后，家蠅幼蟲體內(nèi)氧化還原水平失衡，發(fā)生氧化損傷。

圖5 家蠅2齡幼蟲受到鹽酸阿霉素(A)和紫外線(B)脅迫處理后Mdogg1的表達(dá)量Fig.5 Expression levels of Mdogg1 in the 2nd instar larvae of Musca domestica after exposed to doxorubicin hydrochloride (A) and ultraviolet (B)CK:未經(jīng)任何處理的對(duì)照組Control group without treatment.2齡幼蟲浸泡于0.1 g/L DOX溶液中30 min并恢復(fù)6,12和24 h后,或在280-315 nm紫外線(強(qiáng)度5 J/cm2)下分別照射5,10,20和30 min后檢測基因表達(dá)量。The gene expression level was detected after the 2nd instar larvae were soaked in 0.1 g/L DOX solution for 30 min and then recovered for 6,12 and 24 h,or exposed to UV (280-315 nm) at the dose of 5 J/cm2 for 5,10,20 and 30 min,respectively.

圖6 敲低Mdogg1表達(dá)對(duì)家蠅2齡幼蟲體內(nèi)氧化應(yīng)激的影響Fig.6 Effect of knock-down of Mdogg1 on the oxidative stress in the 2nd instar larvae of Musca domesticaA:Mdogg1基因相對(duì)表達(dá)量Relative expression level of Mdogg1;B:8-羥基鳥嘌呤含量8-oxoG content;C:活性氧水平ROS level;D:丙二醛含量MDA content;E:SOD活性SOD activity.注射dsGFP為對(duì)照組。Injection with dsGFP as the control group.

3 討論

DNA損傷修復(fù)是生物體生長發(fā)育過程中的重要事件，修復(fù)基因的表達(dá)紊亂可導(dǎo)致多種代謝疾病的發(fā)生。ogg1基因在哺乳動(dòng)物中的功能已經(jīng)得到充分關(guān)注，然而昆蟲中該基因的功能研究相對(duì)較少。本研究對(duì)家蠅Mdogg1基因進(jìn)行了克隆與生物信息學(xué)分析。MdOGG1蛋白結(jié)構(gòu)中含有與DNA結(jié)合相關(guān)的HhH結(jié)構(gòu)域，還具有核酸內(nèi)切酶Ⅲ保守結(jié)構(gòu)域(ENDO3c)(圖1)，這2個(gè)結(jié)構(gòu)域是MdOGG1發(fā)揮核酸內(nèi)切酶功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，也是具有DNA糖基化酶/AP裂解酶活性的修復(fù)蛋白的共同結(jié)構(gòu)特征(Kimetal.,2012)。對(duì)MdOGG1與幾種模式生物OGG1的氨基酸序列分析顯示，HhH和ENDO3c結(jié)構(gòu)域在不同物種間均存在，這說明OGG1在不同物種間結(jié)構(gòu)保守。選擇昆蟲中OGG1同源蛋白氨基酸序列，分析OGG1在不同物種間聚類分析，結(jié)果顯示昆蟲的OGG1家族成員聚類方式與系統(tǒng)分類地位嚴(yán)格一致(圖2)，說明OGG1在物種間保守而重要。

在不同生長發(fā)育階段中，家蠅卵中的Mdogg1的表達(dá)量最高(圖3:A)。卵中細(xì)胞發(fā)育分化最為迅速，我們推測Mdogg1基因具有調(diào)控生長發(fā)育和能量代謝的作用。有報(bào)道稱蜜蜂中ogg1基因在個(gè)體發(fā)育過程中均呈現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)狀態(tài)，該基因?qū)τ诰S持西方蜜蜂Apismellifera線粒體功能十分重要(Aamodt,2009)。人體ogg1基因在胚胎組織和睪丸組織中顯著高表達(dá)，具有維持遺傳物質(zhì)穩(wěn)定和參與胚胎發(fā)育的重要作用(Audebertetal.,2002)。脂肪體是家蠅中重要的代謝調(diào)控中樞和免疫調(diào)節(jié)器官(Wangetal.,2020)。本研究顯示，Mdogg1基因在家蠅幼蟲脂肪體中表達(dá)量最高(圖3:B)，暗示該基因具有參與機(jī)體能量代謝和免疫調(diào)控的功能。對(duì)生物體進(jìn)行外源脅迫因子處理，引發(fā)機(jī)體氧化應(yīng)激，可以觸發(fā)體內(nèi)氧化還原基因的表達(dá)變化，這是研究基因功能的有效手段(Kimetal.,2011;Wonetal.,2012;Tangetal.,2019)。因此，我們進(jìn)一步對(duì)家蠅分別進(jìn)行CdCl2、DOX和UV脅迫處理，研究Mdogg1基因的表達(dá)變化規(guī)律。

鎘能夠引起細(xì)胞內(nèi)金屬離子失衡，破壞含有金屬離子的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和活性，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生氧化損傷(Kumar and Sharma,2019)。本研究顯示，CdCl2處理導(dǎo)致家蠅幼蟲中8-羥基鳥嘌呤含量出現(xiàn)顯著上升現(xiàn)象(圖4:B)，且與CdCl2暴露劑量呈現(xiàn)典型的濃度依賴效應(yīng)。值得指出的是，2.5-20 mmol/L濃度范圍內(nèi)CdCl2刺激會(huì)逐漸上調(diào)家蠅幼蟲Mdogg1基因轉(zhuǎn)錄(圖4:A)。我們推測Mdogg1在抗逆過程中表達(dá)量升高與是其響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)氧化水平的直接體現(xiàn)，即機(jī)體通過調(diào)高M(jìn)dogg1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，修復(fù)受損傷的DNA，并發(fā)揮維持家蠅體內(nèi)氧化還原平衡狀態(tài)的作用。DOX是一種對(duì)包括白血病在內(nèi)的多種惡性腫瘤具有抑制作用的蒽環(huán)類藥物，該藥物發(fā)揮作用過程中會(huì)誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激(Mortonetal.,2019)。紫外線輻射可引發(fā)人和動(dòng)物皮膚光老化，造成DNA、脂質(zhì)產(chǎn)生明顯的氧化應(yīng)激損傷(Cadet and Wagner,2013)。我們實(shí)驗(yàn)室前期研究顯示，0.1 g/L的DOX處理家蠅2齡幼蟲30 min后，會(huì)誘導(dǎo)其發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)(Tangetal.,2019;Fengetal.,2020)；并且，5 J/cm2的紫外線照射也會(huì)引發(fā)家蠅2齡幼蟲體內(nèi)MDA和ROS水平顯著增加(藺冬冬等,2019)。本研究表明，Mdogg1基因轉(zhuǎn)錄水平也會(huì)受到相同劑量DOX和紫外線的脅迫處理而上調(diào)(圖5)，這說明該基因具有響應(yīng)家蠅體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的功能。

ogg1基因功能在人和哺乳動(dòng)物中的研究較為深入。例如，潰瘍性結(jié)腸炎患者體內(nèi)ogg1表達(dá)水平與氧化應(yīng)激水平呈現(xiàn)正相關(guān)(Kumagaeetal.,2018)。Kim等(2016)發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素誘導(dǎo)小鼠Musmusculus發(fā)生炎癥反應(yīng)后，與氧化應(yīng)激信號(hào)通路密切相關(guān)的信號(hào)分子STAT1(signal transducer and activator of transcription 1)會(huì)結(jié)合到ogg1基因啟動(dòng)子區(qū)域以調(diào)控該基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。并且，當(dāng)細(xì)胞受到嚴(yán)重的氧化脅迫時(shí)，OGG1會(huì)與受損DNA結(jié)合形成中間物，進(jìn)而激活DNA損傷信號(hào)物PARP1[poly(ADP-ribose) polymerase 1]的活性，從而啟動(dòng)受損細(xì)胞凋亡途徑，以保護(hù)機(jī)體免于更為嚴(yán)重的損害(Wangetal.,2018)。近些年，ogg1基因在無脊椎動(dòng)物中的研究也開始獲得關(guān)注。Kim等(2012)使用紫外線和重金屬處理劍水溞Tigriopusjaponicus，發(fā)現(xiàn)ogg1基因表達(dá)呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢，推測該基因具有保護(hù)機(jī)體免于環(huán)境污染物損傷的作用。Alaraby等(2017)等使用重鉻酸鉀飼喂黑腹果蠅，發(fā)現(xiàn)ogg1基因表達(dá)發(fā)生下調(diào)；他們進(jìn)一步對(duì)黑腹果蠅飼喂納米氧化銅顆粒(一種抗腫瘤潛在藥物)，ogg1基因又呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢。另一項(xiàng)黑腹果蠅相關(guān)研究顯示，20 mmol/L百草枯處理12 h可引發(fā)線粒體功能損傷和黑腹果蠅OGG1酶活性下降(Sandersetal.,2017)。Yasukawa等(2015)研究也顯示10 mmol/L百草枯處理的黑腹果蠅會(huì)抑制ogg1基因表達(dá)，并伴隨8-羥基鳥嘌呤水平的顯著上升。

本研究顯示，家蠅Mdogg1表達(dá)水平與CdCl2處理劑量密切相關(guān)，并伴隨家蠅中DNA氧化損傷產(chǎn)物8-羥基鳥嘌呤水平持續(xù)增加(圖4)。我們分析，低劑量的脅迫劑量會(huì)激發(fā)Mdogg1基因表達(dá)，以修復(fù)體內(nèi)DNA損傷；隨著處理劑量的增大，機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)崩潰，Mdogg1會(huì)發(fā)生下調(diào)表達(dá)趨勢。據(jù)此，我們認(rèn)為Mdogg1基因具有維持家蠅體內(nèi)氧化還原平衡的作用。為了驗(yàn)證該推測，我們使用RNAi技術(shù)敲低家蠅幼蟲中Mdogg1表達(dá)。我們進(jìn)行RNAi干擾實(shí)驗(yàn)時(shí)，首先驗(yàn)證了dsRNA注射家蠅幼蟲后4個(gè)時(shí)間點(diǎn)(6,12,24和48 h)的Mdogg1表達(dá)量變化，結(jié)果顯示Mdogg1的表達(dá)量在RNAi干擾24 h和48 h時(shí)均發(fā)生顯著降低(數(shù)據(jù)未呈現(xiàn))，且24 h時(shí)干擾效果最好(圖6:A)。因此，本研究隨后針對(duì)干擾24 h后的家蠅幼蟲進(jìn)行體內(nèi)氧化還原指標(biāo)測定，我們發(fā)現(xiàn)，家蠅幼蟲不僅表現(xiàn)出ROS水平升高，而且8-羥基鳥嘌呤和MDA的含量均出現(xiàn)顯著上升，伴隨SOD活性顯著降低(圖6:B～E)。細(xì)胞內(nèi)氧化失衡會(huì)導(dǎo)致ROS暴發(fā)，并攻擊細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸的雙鍵，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化損傷而積累MDA。因此，細(xì)胞中ROS和MDA水平升高是機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志。本研究對(duì)Mdogg1基因的敲低表達(dá)后，家蠅幼蟲體內(nèi)發(fā)生氧化還原平衡紊亂?；诖?，我們認(rèn)為Mdogg1具有維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡的功能。再結(jié)合Mdogg1對(duì)于CdCl2、DOX和UV脅迫處理的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)結(jié)果，我們認(rèn)為該基因直接參與了家蠅氧化還原平衡的調(diào)控，具有保護(hù)機(jī)體抵抗氧化損傷的生物學(xué)效應(yīng)。最新研究顯示，ogg1不僅具有DNA修復(fù)功能，還可以調(diào)控多種細(xì)胞代謝通路，維持機(jī)體代謝平衡。例如，Simon等(2020)發(fā)現(xiàn)，ogg1基因敲除的小鼠會(huì)易發(fā)生腸道炎癥和肥胖，并導(dǎo)致腸道微生物菌群變化；ogg1基因敲除的小鼠受到缺氧脅迫處理后，其腦和肺部組織中多種與炎癥調(diào)控的基因發(fā)生表達(dá)紊亂(Rognlienetal.,2018)。在本研究中，我們通過外源刺激物脅迫處理和RNAi技術(shù)研究了Mdogg1的生理功能，發(fā)現(xiàn)該基因具有維持家蠅體內(nèi)氧化還原平衡的作用。當(dāng)然，Mdogg1發(fā)揮調(diào)控作用的分子機(jī)制還需要在后續(xù)工作中深入研究。