李慶飛，張曼楠，王夢(mèng)夢(mèng)，陳碧華，王廣印，周俊國(guó)，李新崢

(1.河南科技學(xué)院 園藝園林學(xué)院，河南 新鄉(xiāng)453003；2.河南省園藝植物資源利用與種質(zhì)創(chuàng)新工程研究中心，河南 新鄉(xiāng) 453003)

南瓜是葫蘆科南瓜屬的1年生蔓性草本植物，在世界各地廣泛栽培，主要栽培種有中國(guó)南瓜(CucurbitamoschataD.)、印度南瓜(CucurbitamaximaD.)和美洲南瓜(CucurbitapepoL.)，其中，中國(guó)南瓜栽培范圍最為廣泛[1]。南瓜是一種具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值的蔬菜作物[2-3]，且因口感好而備受人們喜愛。南瓜是典型的雌雄異花同株植物，雜種優(yōu)勢(shì)明顯，南瓜的性別決定是南瓜雜交優(yōu)勢(shì)利用的基礎(chǔ)。南瓜屬植物的花性別分化表現(xiàn)為，基部節(jié)位首先著生雄花，雄花產(chǎn)生后，雌花和雄花交替產(chǎn)生，最后階段多產(chǎn)生雌花，但總體雄花的比例遠(yuǎn)高于雌花。葫蘆科植物的性別表達(dá)受遺傳、激素和環(huán)境等多種因子調(diào)控。目前已報(bào)道的參與植物花性別分化的激素有多種，包括乙烯、生長(zhǎng)素、赤霉素、細(xì)胞分裂素、脫落酸、茉莉酸等[4-10]。

乙烯在葫蘆科作物花性別表達(dá)和花發(fā)育中起著決定性作用。乙烯被認(rèn)為是潛在的促雌激素，外源乙烯或乙烯釋放劑可以增加雌花的數(shù)量[11-12]。乙烯抑制劑硝酸銀可以導(dǎo)致乙烯合成途徑中的ACC合成酶基因ACS受到抑制，乙烯合成減少，誘導(dǎo)西瓜純雌植株雄性化[13]。葫蘆科作物中，黃瓜的花性別分化研究已較為深入。研究表明，黃瓜花性別分化受F、M和A基因的控制[14]。3個(gè)基因都編碼乙烯合成途徑中的關(guān)鍵限速酶1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合酶(ACS)[15]。除ACS外，乙烯合成途徑中的另一關(guān)鍵酶1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶(ACO)在雌花的發(fā)育中也扮演著重要的角色。研究表明，ACO基因?qū)Υ苹ㄐ钠さ陌l(fā)育至關(guān)重要，黃瓜CsACO2基因突變，導(dǎo)致植株莖尖組織中的乙烯損失50%，進(jìn)一步導(dǎo)致突變植株只著生雄花[16]。在其他作物中研究發(fā)現(xiàn)，施加外源乙烯利后，其ACO的表達(dá)量升高[17-18]。乙烯信號(hào)響應(yīng)基因也參與了瓜類作物的花性別分化。乙烯可以通過乙烯接受體CsETR1特異地誘導(dǎo)黃瓜花藥原基的DNA損傷，從而抑制雌花中雄蕊的發(fā)育[6,19-21]。研究發(fā)現(xiàn)，外源施用乙烯利后，乙烯受體基因CS-ETR2和CS-ERS的轉(zhuǎn)錄水平提高，而施用乙烯合成抑制劑AVG時(shí)二者的轉(zhuǎn)錄水平被抑制[22]。由此可見，在其他作物中乙烯關(guān)鍵合成酶基因ACO和乙烯接受體基因ETR對(duì)乙烯利和乙烯抑制劑具有一定的響應(yīng)。

生產(chǎn)中乙烯利與乙烯抑制劑常被用作黃瓜、西瓜、甜瓜的促雌促雄劑，但其作用機(jī)制尚不明確，且在南瓜屬中應(yīng)用較少，尤其是栽培面積最為廣泛的中國(guó)南瓜，其應(yīng)用劑量及作用效果鮮有報(bào)道。為了明確乙烯利與乙烯抑制劑對(duì)中國(guó)南瓜花性別分化的作用，以3份中國(guó)南瓜自交系為材料，研究乙烯利和乙烯抑制劑硫代硫酸銀(STS)處理對(duì)中國(guó)南瓜花性別分化的影響，探究乙烯關(guān)鍵合成酶基因ACO和乙烯接受體基因ETR對(duì)乙烯利和乙烯抑制劑處理的響應(yīng)，以期為生產(chǎn)中提高南瓜坐果率、控制花期，進(jìn)一步深入了解外源激素處理對(duì)內(nèi)源基因水平的影響，以及揭示乙烯利與乙烯抑制劑調(diào)控瓜類作物花性別分化的作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用3個(gè)中國(guó)南瓜自交系336、229-1、6-10均為河南科技學(xué)院南瓜課題組保存的高代自交系，表型性狀穩(wěn)定一致。所用試劑為 0.1% Tween-20、乙烯利(100 mg/L)和乙烯抑制劑硫代硫酸銀(STS，600 mg/L，由硝酸銀和硫代硫酸鈉溶液配制而成)。配制STS時(shí)，以銀離子濃度為準(zhǔn)，將配制好的硝酸銀緩慢倒入配制好的硫代硫酸鈉溶液中，混勻，溶液由蒸餾水配制。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料的種植 選用飽滿無病蟲的南瓜種子進(jìn)行浸種催芽。露白后移至28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽，待芽生長(zhǎng)至0.2～0.4 cm時(shí)，將南瓜播種于直徑為34 cm的塑料栽培盆中，每個(gè)自交系種植15株，生長(zhǎng)期間不同自交系植株保持相同田間管理。待南瓜長(zhǎng)至幼苗期3～4片真葉展開時(shí)(南瓜花性別分化的決定時(shí)期)，對(duì)生長(zhǎng)點(diǎn)分別進(jìn)行乙烯利和STS處理。

1.2.2 乙烯利和STS的處理及指標(biāo)測(cè)定 分別用乙烯利(100 mg/L)、STS(600 mg/L)和0.1% Tween-20(對(duì)照)噴施南瓜植株生長(zhǎng)點(diǎn)，每個(gè)處理重復(fù)5次，處理濃度參照楊曉霞等[23]的方法。噴施時(shí)，使生長(zhǎng)點(diǎn)濕潤(rùn)且不滴液為止，每隔2 d噴施1次，共噴施3次。處理后觀察其對(duì)幼苗表型的影響，并在開花結(jié)瓜期調(diào)查南瓜主莖20節(jié)以內(nèi)的雌花數(shù)量、雄花數(shù)量、第一雌花節(jié)位以及雌雄花器官結(jié)構(gòu)的變化，以確定乙烯對(duì)南瓜花性別分化及發(fā)育的影響。

1.2.3 葉片乙烯相關(guān)基因ACO和ETR的表達(dá)分析 分別取乙烯利及STS處理2 h的南瓜幼苗生長(zhǎng)點(diǎn)和未處理的生長(zhǎng)點(diǎn)附近葉片，檢測(cè)乙烯合成酶基因ACO及乙烯受體基因ETR的表達(dá)水平。利用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行熒光定量引物的設(shè)計(jì)，引物序列見表1。采用Takara公司的RNA提取及熒光定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行葉片總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄。熒光定量PCR按照Takara公司的SYBR?Premix ExTaqTMⅡ熒光染料說明書進(jìn)行。以南瓜β-Actin7為內(nèi)參基因。擴(kuò)增反應(yīng)為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，62 ℃退火并延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。用 2-ΔΔCT法獲得目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量[24]。

表1 熒光定量表達(dá)分析所用引物序列Tab.1 Primer sequences used in qRT-PCR analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 乙烯利和STS對(duì)中國(guó)南瓜幼苗及花發(fā)育的影響

對(duì)乙烯利和STS處理后的南瓜幼苗進(jìn)行性狀觀察，未發(fā)現(xiàn)對(duì)南瓜幼苗生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯影響。圖1為乙烯利和STS處理2 d的幼苗。后期對(duì)南瓜雌花、雄花器官的結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，也未發(fā)現(xiàn)明顯異常，說明乙烯利與STS的處理濃度比較適宜用來調(diào)控中國(guó)南瓜的花性別分化，不會(huì)對(duì)植株幼苗及花器官結(jié)構(gòu)的發(fā)育產(chǎn)生影響。

2.2 乙烯利和STS對(duì)中國(guó)南瓜花性別表達(dá)的影響

通過對(duì)乙烯利及STS處理后3個(gè)南瓜自交系的第一雌花節(jié)位以及20節(jié)內(nèi)的雌花數(shù)量及雄花數(shù)量調(diào)查發(fā)現(xiàn)，乙烯利處理后，3個(gè)自交系的第一雌花節(jié)位都顯著降低；雌花數(shù)量都有所增加，除自交系6-10增加不顯著外，自交系336和229-1都達(dá)到顯著水平；6-10雄花數(shù)量顯著減少，336和229-1乙烯利處理后雄花數(shù)量沒有顯著變化(表2)。說明乙烯利處理可以顯著降低第一雌花節(jié)位，增加雌花數(shù)量，而對(duì)雄花數(shù)量的影響在不同自交系中存在差異，或顯著減少雄花數(shù)量或?qū)π刍〝?shù)量無顯著影響。STS處理后，3個(gè)自交系的第一雌花節(jié)位都顯著升高，即第一雌花出現(xiàn)延遲；3個(gè)自交系的雄花數(shù)量都有所增加，其中自交系366和229-1雄花數(shù)量增加顯著，6-10增加不顯著；雌花產(chǎn)生數(shù)量表現(xiàn)為明顯降低，其中自交系229-1雌花數(shù)量減少最為顯著(表2)。說明STS處理對(duì)第一雌花節(jié)位和雄花數(shù)量影響較大，可以顯著延遲第一雌花的產(chǎn)生并增加雄花數(shù)量，減少雌花數(shù)量，其對(duì)雄花數(shù)量的增加程度和雌花數(shù)量的減少程度在不同自交系間存在差異。

表2 乙烯利及STS對(duì)中國(guó)南瓜第一雌花節(jié)位及20節(jié)內(nèi)雌花數(shù)量和雄花數(shù)量的影響Tab.2 Effects of ethephon and STS on the node of first female flower and the number of female and male flowers within 20 nodes

2.3 乙烯利和STS對(duì)葉片ACO及ETR表達(dá)水平的影響

由圖2可見，乙烯利處理后，葉片乙烯合成酶基因ACO和乙烯受體基因ETR的表達(dá)水平具有相似的變化趨勢(shì)，都表現(xiàn)為乙烯利處理使其表達(dá)量增加，STS處理使其表達(dá)量降低。這說明乙烯利和乙烯抑制劑STS處理不僅能影響內(nèi)源乙烯的合成,還會(huì)影響乙烯的響應(yīng)。乙烯利處理促進(jìn)了ACO和ETR的轉(zhuǎn)錄，而STS抑制了ACO和ETR的轉(zhuǎn)錄。

3 結(jié)論與討論

南瓜是典型的雌雄異花同株植物。雌花的數(shù)量和比例直接關(guān)系到瓜類作物的產(chǎn)量。研究表明，植物激素尤其乙烯在葫蘆科瓜類作物性別分化中具有重要作用[4-5,10-11,25]。乙烯利常被用來促進(jìn)瓜類作物雌花的產(chǎn)生。外源乙烯或乙烯釋放劑處理可以增加雌雄同株或雄性株中雌花的數(shù)量，乙烯抑制劑硝酸銀處理可以抑制乙烯合成途徑中ACS基因的表達(dá)，乙烯合成減少，誘導(dǎo)西瓜純雌植株雄性化[11-13]。然而，在瓜類作物中乙烯合成途徑中調(diào)控雌花發(fā)育的關(guān)鍵基因ACO對(duì)外源乙烯及乙烯抑制劑處理的響應(yīng)尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，乙烯利處理南瓜幼苗生長(zhǎng)點(diǎn)會(huì)使葉片中ACO表達(dá)量升高，這與朱敏等[17]和雷明等[18]的研究結(jié)果一致。關(guān)于乙烯信號(hào)響應(yīng)基因，在黃瓜中，施用外源乙烯利會(huì)使CS-ETR2和CS-ERS的轉(zhuǎn)錄水平被提高，而施用乙烯抑制劑氨基乙氧基乙烯甘氨酸(AVG)時(shí)二者的轉(zhuǎn)錄水平被抑制[6,19-22]。本研究結(jié)果顯示，乙烯利處理使乙烯接受體基因ETR表達(dá)水平上升，乙烯抑制劑STS處理使其表達(dá)水平下降，與以上黃瓜[22]中的研究結(jié)果相似。這說明乙烯利和乙烯抑制劑對(duì)乙烯合成基因和響應(yīng)基因在轉(zhuǎn)錄水平上都有一定的影響。

另外，本研究通過乙烯利和乙烯抑制劑STS處理中國(guó)南瓜發(fā)現(xiàn)，乙烯利可以顯著降低第一雌花節(jié)位，促進(jìn)雌花的產(chǎn)生；STS處理延遲了第一雌花的產(chǎn)生并增加雄花數(shù)量，該研究結(jié)果與楊曉霞等[23]的研究結(jié)果一致，但本研究還進(jìn)一步探究了乙烯利和STS對(duì)乙烯主要合成和響應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。研究結(jié)果暗示，乙烯利顯著降低第一雌花節(jié)位，促進(jìn)雌花的產(chǎn)生可能與其誘導(dǎo)乙烯合成基因ACO及受體基因ETR的高表達(dá)有關(guān)。STS處理后植株第一雌花的產(chǎn)生表現(xiàn)延遲并增加了雄花數(shù)量，可能與其抑制了乙烯合成基因ACO及受體基因ETR的表達(dá)有關(guān)；該研究結(jié)果與ZHANG等[13]研究發(fā)現(xiàn)的乙烯抑制劑硝酸銀可以導(dǎo)致ACS基因受到抑制，從而誘導(dǎo)西瓜植株雄性化的結(jié)果相呼應(yīng)。

該研究結(jié)果從生理和分子兩方面，探究乙烯利與乙烯抑制劑處理對(duì)中國(guó)南瓜花性別分化和對(duì)乙烯合成基因和受體基因表達(dá)的影響，不僅為生產(chǎn)中調(diào)控中國(guó)南瓜的花性別分化提供了研究基礎(chǔ)，同時(shí)也為闡明外源激素及激素抑制劑誘導(dǎo)雌花、雄花的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。