鮑 印，翟洪月，李慧敏，袁志喬，馬玉靜，丁雨善，闞云超，姚倫廣，田志軍，冷超糧

(1.南陽(yáng)師范學(xué)院 河南省伏牛山昆蟲(chóng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河南省動(dòng)物疫病診斷與綜合防控工程技術(shù)研究中心，河南 南陽(yáng) 473000； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 哈爾濱獸醫(yī)研究所/獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069)

河南是我國(guó)養(yǎng)豬大省，養(yǎng)豬業(yè)在國(guó)內(nèi)具有舉足輕重的地位。位于豫西南地區(qū)的南陽(yáng)市、駐馬店市和信陽(yáng)市，是我國(guó)養(yǎng)豬生產(chǎn)較為集中的區(qū)域。隨著規(guī)?；?、集約化程度的不斷提高，病毒性傳染病對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的危害日趨嚴(yán)重。除非洲豬瘟(ASF)外，豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)、豬瘟(CSF)、豬偽狂犬病(PR)和豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)是危害豬群健康的4種最主要病毒性傳染病[1-4]。這些傳染病在我國(guó)具有波及范圍廣、感染時(shí)間長(zhǎng)、消除困難、診斷與治療復(fù)雜、隱性帶毒、易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，不僅影響母豬健康和生產(chǎn)性能，還造成仔豬免疫功能下降，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失[5-7]。為掌握這4種傳染病在豫西南地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)的流行情況，對(duì)2017—2019年收集的相關(guān)樣品進(jìn)行病原學(xué)和血清學(xué)檢驗(yàn)，以充分了解豫西南地區(qū)豬主要病毒性疾病的流行特點(diǎn)及規(guī)律，并為其防控提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病料來(lái)源

2017—2019年來(lái)自豫西南地區(qū)(南陽(yáng)、駐馬店、信陽(yáng)市)57個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)送檢的723份病豬組織樣品(淋巴結(jié)、肺臟、脾臟、腎臟、腦等)和2 476份血液樣品，用于病原和抗體檢測(cè)。

1.2 主要試劑

病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒購(gòu)自杭州博日科技有限公司，TransScript One-Step RT-PCR Super Mix、2×EasyTaq PCR Super Mix、TransTaq DNA Polymerase High Fidelity(HiFi)等均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，豬瘟病毒(CSFV)ELISA抗體檢測(cè)試劑盒、豬偽狂犬病病毒(PRV)gE和gB ELISA抗體檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)IDEXX公司，豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)ELISA抗體檢測(cè)試劑盒和PCV2抗體ELISA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自韓國(guó)金諾公司。

1.3 主要儀器

高速離心機(jī)(Eppendorf Centrifuge 5417C)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，PCR儀(BIO-RAD C1000 Touch)和凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD universal HoodⅡ)購(gòu)自BIO-RAD公司，核酸電泳儀(六一DYY-12)購(gòu)自北京六一儀器廠，超凈工作臺(tái)(蘇州凈化SW-CJ-1B)購(gòu)蘇州凈化工作臺(tái)有限公司。

1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank已發(fā)表的序列，應(yīng)用Oligo 7.0軟件設(shè)計(jì)CSFV、PRRSV、PCV2和PRV的引物，并由蘇州泓訊生物科技有限公司合成。引物信息詳見(jiàn)表1。

表1 本研究中用到的引物序列Tab.1 Primes used in this study

1.5 病料的處理和檢測(cè)

根據(jù)臨床癥狀與病理變化進(jìn)行初步診斷，選擇肺臟、淋巴結(jié)、脾臟、腎臟和腦等病變明顯的組織作為檢測(cè)病料，其余置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。取適量待檢病料，加入400～500 μL無(wú)菌PBS緩沖液進(jìn)行研磨，離心后取200 μL上清置于無(wú)菌EP管中，按病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作方法進(jìn)行基因組提取。以提取的基因組為模板，以相應(yīng)的病毒引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。對(duì)于抗體檢測(cè)，首先將待檢血液分離出血清，然后分別按照CSFV、PRRSV、PCV2、PRV gE和PRV gB ELISA抗體試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果

對(duì)2017—2019年來(lái)自豫西南地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)送檢的病料，分別進(jìn)行CSFV、PRRSV、PCV2和PRV病原的檢測(cè)。

由圖1所示，CSFV、PRRSV、PCV2和PRV的平均陽(yáng)性率分別為42.20%(192/455)、56.85%(328/577)、45.03%(136/302)和28.85%(73/253)。CSFV在2017—2018年的感染率為49.08%(107/218)～50.00%(43/86)，然而在2019年大幅下降，僅為27.81%(42/151)。PRRSV陽(yáng)性率在2017—2019年一直呈緩慢下降趨勢(shì)，由61.16%(74/121)下降至52.97%(116/219)。PCV2在2019年大幅下降，由2017—2018年的49.48%(48/97)～58.65%(61/104)下降至2019年的26.73%(27/101)。PRV的陽(yáng)性率也呈下降趨勢(shì)，由2017年的51.43%(18/35)下降至2018年的33.33%(45/135)，2019年下降至12.05%(10/83)。以上結(jié)果表明，4種常見(jiàn)的豬病原中，PRRSV、CSFV和PCV2的感染率明顯高于PRV。此外，CSFV、PCV2和PRV的病原檢出率在2019年大幅下降，可能與ASF出現(xiàn)后豬場(chǎng)重視生物安全有關(guān)。

2.2 PRRSV單一和混合感染情況

由圖2可知，PRRSV單一檢出率為56.71%(186/328)?；旌细腥局?，PRRSV與CSFV雙重感染檢出率最高，為12.20 %(40/328)，其次為PRRSV與PCV2雙重感染，檢出率為11.28%(37/328)，PRRSV與PRV的雙重感染檢出率僅為0.61%(2/328)。

此外，PRRSV、CSFV和PCV2三重感染檢出率為8.84%(29/328)，RRSV、CSFV和PRV三重感染檢出率為6.40%(21/328)，而PPRRSV、PCV2和PRV三重感染檢出率為3.96%(13/328)。綜合這些結(jié)果表明，PRRSV與CSFV、PCV2是主要的混合感染形式，與PRV混合感染較少，且多數(shù)伴隨PCV2的感染。

2.3 血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果

對(duì)2017—2019年豫西南地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)送檢的血清樣品分別進(jìn)行CSFV、PRRSV、PCV2、PRV gE和PRV gB抗體檢測(cè)。由圖3可知，CSFV、PRRSV、PCV2、PRV gE和PRV gB的抗體平均陽(yáng)性率分別為78.37%(1 841/2 349)、75.93%(1 565/2 061)、84.62%(682/806)、33.12%(627/1 893)和94.00%(1 504/1 600)。CSFV抗體陽(yáng)性率在2017年和2019年相對(duì)較高，分別為79.86%(234/293)和80.21%(855/1 066)，2018年為75.96%(752/990)。PRRSV抗體陽(yáng)性率在2017～2019年基本穩(wěn)定，分別為77.63%(170/219)、74.65%(595/797)和76.56%(800/1 045)。PCV2抗體陽(yáng)性率在2017年較低，為80.47%(103/128)，而在2018年和2019年相對(duì)較高，分別為87.69%(292/333)和83.19%(287/345)。PRV gE抗體陽(yáng)性率由2017—2018年的37.57%(260/692)～38.20%(68/178)下降到2019年的29.23%(299/1 023)。2017—2019年，PRV gB抗體一直保持較高的陽(yáng)性率，在92.90%(785/845)～97.22%(140/144)。以上結(jié)果表明，目前我國(guó)規(guī)?；i場(chǎng)的免疫意識(shí)普遍較強(qiáng)，免疫效果較為理想。

3 結(jié)論與討論

2017年起，國(guó)家正式取消了CSF和PRRS的強(qiáng)制免疫計(jì)劃，促使養(yǎng)殖企業(yè)更加注重科學(xué)免疫，提升生物安全意識(shí)，建立綜合性的疾病防控體系。本研究對(duì)2017—2019年豫西南地區(qū)規(guī)模化豬場(chǎng)的病原檢測(cè)顯示，CSFV、PRRSV和PCV2的平均陽(yáng)性率均達(dá)到了42%以上，PRV的陽(yáng)性率也達(dá)到了28.85%，這與汪志等[8]對(duì)華南地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)的病原檢測(cè)結(jié)果較為一致，而賀會(huì)利等[9]對(duì)2015—2017年廣西規(guī)模化豬場(chǎng)的病原檢測(cè)顯示，CSF、PRRS、PCV2和PR的感染率分別僅為2.06%、14.43%、14.32%和12.1%，這可能是由于本研究樣品均來(lái)自臨床上發(fā)病豬群，感染率相對(duì)較高。CSFV、PCV2和PRV的病原檢出率以及PRV gE抗體的陽(yáng)性率在2019年明顯減低，這可能是因?yàn)橛捎贏SF的出現(xiàn)，豬場(chǎng)的生物安全空前加強(qiáng)，疫病發(fā)生率明顯降低。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)病豬群中混合感染較為普遍，且多數(shù)是PRRSV伴隨CSFV、PCV2的二重感染或三重感染，這與之前的報(bào)道較為一致[10]。本研究的血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，CSFV、PRRSV、PCV2、PRV gE和PRV gB抗體的平均陽(yáng)性率分別為78.37%、75.93%、84.62%、33.12%和94.00%，與之前報(bào)道的山東、江西以及華南地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)的檢測(cè)結(jié)果基本一致[8-9,11]。表明目前我國(guó)規(guī)?；i場(chǎng)的免疫意識(shí)普遍較強(qiáng)，免疫效果均能達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

CSF作為一種傳統(tǒng)的豬烈性傳染病，自兔化弱毒疫苗(C株)應(yīng)用以來(lái)，該病得到有效控制。然后，2014年8月以來(lái)，我國(guó)部分規(guī)?；i場(chǎng)正常免疫C株疫苗的豬群出現(xiàn)CSFV感染，隨后鑒定出是由一類(lèi)新的CSFV 2.1d亞型毒株引起[12-14]。近幾年，2.1d亞型毒株不斷出現(xiàn)，且最近報(bào)道日本時(shí)隔26 a再次發(fā)生CSFV疫情，其流行毒株與2.1d亞型毒株高度相似[15-16]。本研究中，2017—2019年豬群中CSFV抗體一直維持較高的陽(yáng)性率，但仍有較高比例的CSFV感染，其深層次原因，如免疫程序、疫苗質(zhì)量以及其他病原的干擾等值得探究。這也提示要持續(xù)對(duì)CSFV的發(fā)生及流行進(jìn)行監(jiān)測(cè)，同時(shí)要開(kāi)展CSFV新疫苗的儲(chǔ)備研究。

PRRS是規(guī)模化豬場(chǎng)最重要的烈性傳染病之一[17]。近年來(lái)，PRRSV持續(xù)變異，主流毒株由高致病性PRRSV(HP-PRRSV)逐步演化為目前的類(lèi)NADC30毒株，且類(lèi)QYYZ、類(lèi)NADC34等新毒株不斷出現(xiàn)，呈現(xiàn)散發(fā)或局部流行，給該病的防控帶來(lái)了更為嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[18]。本研究中，2017—2019年P(guān)RRSV病原平均檢出率達(dá)56.85 %，且近幾年居高不下，也說(shuō)明了該病防控的復(fù)雜性。此外，針對(duì)現(xiàn)有PRRSV流行毒株呈現(xiàn)多樣性、沒(méi)有特效治療性藥物、商品化疫苗不能提供完全保護(hù)等問(wèn)題，豬場(chǎng)應(yīng)采取包括生物安全、疫苗免疫以及相關(guān)藥物保健等綜合性的防控措施，同時(shí)，迫切需要開(kāi)發(fā)新型PRRSV疫苗。

PCV2感染會(huì)造成豬生長(zhǎng)緩慢，飼料產(chǎn)出比下降，養(yǎng)殖成本增加，而且破壞豬體免疫系統(tǒng)，繼發(fā)其他病原感染，給養(yǎng)殖場(chǎng)造成重大損失[19-20]。本研究中，2017—2019年P(guān)CV2病原的平均陽(yáng)性率達(dá)45.03%，說(shuō)明豬群PCV2的感染非常普遍。PCV2抗體平均陽(yáng)性率也高達(dá)84.62%，但這很可能是野毒感染的原因。目前，PCV2的防控主要依靠疫苗免疫。但由于毒株變異、疫苗質(zhì)量差以及免疫程序不合理等因素，加上一些豬場(chǎng)對(duì)PCV2的免疫重視不夠，養(yǎng)殖觀念落后，常造成免疫失敗。因此，當(dāng)前豬場(chǎng)應(yīng)重視PCV2的危害，選用優(yōu)質(zhì)疫苗免疫，防止繼發(fā)感染，注重提升豬群的整體免疫力等綜合性的防控措施。

PR作為一個(gè)“老病”，長(zhǎng)期以來(lái)都比較穩(wěn)定，并且曾經(jīng)多數(shù)規(guī)模化豬場(chǎng)都實(shí)現(xiàn)了凈化。但自2011年下半年以來(lái)，我國(guó)多地正常免疫PRV Bartha-k61疫苗的規(guī)?；i場(chǎng)暴發(fā)了PR，造成母豬流產(chǎn)，產(chǎn)弱仔、死胎，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失。后經(jīng)鑒定是出現(xiàn)了致病力增強(qiáng)的PRV變異株，而現(xiàn)有疫苗不能提供完全保護(hù)[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，2017—2019年P(guān)RV病原陽(yáng)性率和gE抗體陽(yáng)性率逐漸下降，但豬群PRV感染仍較為嚴(yán)重，防控和凈化任務(wù)仍十分艱巨。但隨著PRV變異株疫苗的陸續(xù)上市，這種情況應(yīng)該會(huì)有較大改善，并最終實(shí)現(xiàn)凈化。

本研究通過(guò)對(duì)2017—2019年豫西南地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)主要病毒性傳染病的流行病學(xué)調(diào)查與分析可知，CSFV、PRRSV、PCV2和PRV的感染仍具有普遍性，且部分豬場(chǎng)存在以PRRSV為主的混合感染。值得一提的是，CSFV、PCV2和PRV的病原檢出率在2019年大幅下降，這與ASF出現(xiàn)后豬場(chǎng)重視生物安全不無(wú)關(guān)系，也說(shuō)明豬場(chǎng)持續(xù)做好生物安全管理、積極加強(qiáng)疫病檢測(cè)的重要性。