嚴 丹，蔡延渠，李鐵程，陳必添，馮華仔，張志鵬

（1.湖北科技學院藥學院，湖北 咸寧 437100；2.廣東藥科大學新藥研發(fā)中心，廣州 510006；3.陽江市金星種養(yǎng)產(chǎn)業(yè)研究院，廣東 陽江 529500）

航天雜交構樹（Broussonetia papyrifera）為?？茦嫎鋵俣嗄晟淙~喬木，是中國科學院植物研究所利用現(xiàn)代生物技術和傳統(tǒng)雜交育種方法，采取基因工程、新種質(zhì)創(chuàng)制和航天搭載誘變等技術培育出的多功能林木樹種［1］。

中醫(yī)認為，構樹的乳液、根皮、樹皮、葉、果實及種子均可入藥；其中果實為中藥褚實子，與根共入藥，具有補腎、利尿、強筋骨之功效。但是，目前構樹的價值多體現(xiàn)于紙張加工、飼料生產(chǎn)、園藝綠化等方面［2，3］，在藥用方面的開發(fā)利用甚少，是一種尚未被深入研究和開發(fā)利用的可貴藥用資源?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，天然植物多糖具有抗肝損傷、抗腫瘤、抗病毒、降血糖、抗氧化劑、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性［4］，可廣泛應用于藥品、食品、化妝品等方面［5，6］。但是目前尚無有關構樹葉多糖及其抗氧化活性的研究報道。因此，本研究以航天雜交構樹葉為原料，采用加熱回流提取法，在單因素試驗基礎上，通過Box-Behnken響應面法進行多糖工藝優(yōu)化；同時，體外測定DPPH自由基（DPPH·）、自由基陽離子（ABTS+·）、羥基自由基（·OH）和超氧陰離子（·）的清除率及對鐵的還原力，為構樹葉多糖在醫(yī)藥保健、美容護膚等方面的開發(fā)利用提供依據(jù)，同時也為航天雜交構樹品種的種植推廣提供新動力。

1 材料與方法

1.1 試藥

航天雜交構樹葉樣品由陽江市金星種養(yǎng)產(chǎn)業(yè)研究院提供，經(jīng)廣東藥科大學新藥研發(fā)中心吳燕紅高級工程師鑒定為?？茦嫎鋵贅嫎涞娜~。

D-無水葡萄糖（批號110833-201707，含量99.9%），中國食品藥品檢定研究院；維生素C（VC，批號 SLBN3833V），Sigma 試劑有限公司；D-半乳糖，上海源葉生物有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Thris）、1，1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH）、2，2′-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS），上海麥克林生化科技有限公司；鄰苯三酚、氫氧化鈉、苯酚、濃硫酸、氯仿、正丁醇、過硫酸鉀、抗壞血酸（VC）、鹽酸、無水乙醇、硫酸亞鐵、過氧化氫、二水磷酸二氫鈉、十二水磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、水楊酸、三氯乙酸、氯化鐵均為分析純；水為實驗室自制純水。

1.2 儀器

UV-1700 雙光束紫外分光光度計，日本島津公司；EPED-10TF 純水器，南京益普易達科技發(fā)展有限公司；FreeZone2.5 冷凍干燥機，美國Labconco 公司；LB940 多功能酶標儀，美國 BioTek 公司；BP-211D 電子分析天平，德國 Sartorius 公司；JJ1000Y 電子天平，美國雙杰集團有限公司；RE-52 旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；BHS-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋，江陰市保利科研器械有限公司；pHS-3C pH 計，上海精密科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 構樹葉多糖的提取 將新鮮構樹葉沖洗、烘干，粉碎，過20 目篩，得到構樹葉粉末。取30 g 構樹葉粉末，加入純水，采用加熱回流法提取，以不同的提取溫度、料液比、提取時間、提取次數(shù)等為考察因素。提取液過濾，濾液于75 ℃減壓濃縮至適量，加入乙醇至終體積為濃縮前的85%，冰箱4 ℃靜置過夜后取沉淀冷凍干燥，即得構樹葉多糖［7，8］。

1.3.2 單因素考察 以水為提取溶劑，考察不同提取溫度（60、70、80、90、100 ℃）、料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL）、提取時間（0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 h）和提取次數(shù)（1、2、3、4 次）對構樹葉多糖得率的影響。每次進行單因素試驗時，固定其他因素，考察因素變化，3 次重復。

1.3.3 響應面優(yōu)化設計 通過單因素試驗結果，選擇影響較為顯著的因素，進行3 因素3 水平Box-Behnken 響應面試驗設計。固定提取溫度為100 ℃，以料液比為A因素、提取時間為B因素及提取次數(shù)為C因素，以多糖得率為響應值，采用Design-Ex?pert 8.0 軟件進行二次回歸方程擬合，優(yōu)選構樹葉多糖的最佳提取條件。因素與水平見表1。

表1 響應面法的因素與水平

1.3.4 多糖得率的測定 采用苯酚-硫酸法測定多糖含量，分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 的D-無水葡萄糖標準溶液（0.103 6 mg/mL），補純水至2 mL，加入1.0 mL 5%苯酚溶液、6.0 mL 濃硫酸溶液，沸水浴20 min，取出冷卻至室溫，于490 nm 處測定吸光度（A）。以D-無水葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標（X）、吸光度A為縱坐標（Y）繪制標準曲線，計算構樹葉多糖得率［9］。

構樹葉多糖得率=構樹葉多糖質(zhì)量/構樹葉質(zhì)量×100%

1.3.5 體外抗氧化活性測定

1）清除DPPH·自由基能力測定。準確配制質(zhì)量濃度為 0.35 mg/mL 的 DPPH 儲備液，吸取 0.5 mL 加入1 mL不同濃度樣品溶液（多糖溶液或VC溶液），混勻，室溫下避光反應30 min，于517 nm 處測定吸光度A1；另吸取0.5 mL DPPH 儲備液、1 mL純水，同法測定吸光度A0；另吸取0.5 mL 無水乙醇、1 mL 樣品溶液，同法測定吸光度值A2。按下式計算清除率［10，11］。

清除率=［1-（A1-A2）/A0］×100%

2）清除ABTS+·自由基能力測定。將7 mmol/L的ABTS 溶液和7.35 mmol/L 過硫酸鉀溶液按體積比2∶1 混合，室溫下避光反應 16 h 制備成 ABTS 儲備液，用前稀釋至波長734 nm 處的吸光度A0為0.70±0.2。分別吸取1 mL 不同濃度樣品溶液（多糖溶液或VC 溶液）和2 mL ABTS 稀釋液，超聲30 s，室溫下避光反應10 min，于波長734 nm 處測定吸光度A1。按下式計算清除率。

清除率=（A0-A1）/A0×100%

3）清除·OH 自由基能力測定。吸取不同濃度樣品溶液（多糖溶液或VC 溶液）、6 mmol/L FeSO4溶液及6 mmol/L H2O2溶液各2 mL，混勻后靜置10 min；再加入2 mL 6 mmol/L 水楊酸溶液，靜置30 min，于波長510 nm 處測定吸光度A1；以純水代替水楊酸，同法測定吸光度A2；另以純水為空白，同法測定吸光度A0。按下式計算清除率。

清除率=［1-（A1-A2）］/A0×100%

清除率=［1-（A1-A2）］/A0×100%

5）鐵還原力測定。吸取1 mL 不同濃度樣品溶液（多糖溶液或VC 溶液），加入1%鐵氰化鉀溶液與磷酸緩沖液（pH 6.6）各2.5 mL，50 ℃水浴20 min，取出冷卻至室溫；再加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL，混勻，3 500 r/min 離心 15 min，取上清液 2.5 mL，加入0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液和2.5 mL 純水，20 min后于波長700 nm 處測定吸光度。同時以純水為空白、VC 為陽性對照測吸光度。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

以D-無水葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標（X）、A為縱坐標（Y）繪制標準曲線，得到線性回歸方程：Y=0.066 5X+0.006 14，r=0.999 2，結果顯示在 2.302 2～11.511 1 μg/mL 線性關系較好。

2.2 單因素試驗

2.2.1 提取溫度對構樹葉多糖得率的影響 以料液比1∶30（g/mL）、提取時間2 h、提取1 次為固定因素，考察提取溫度對構樹葉多糖得率的影響。由圖1 可知，構樹葉多糖得率隨著提取溫度（60～100 ℃）的提高而升高，以100 ℃時最高，得率為5.57%。由于水溶劑在常壓下的沸點溫度為100 ℃，因此選擇最佳提取溫度為100 ℃。

圖1 提取溫度對構樹葉多糖得率的影響

2.2.2 料液比對構樹葉多糖得率的影響 以提取溫度100 ℃、提取時間2 h、提取1 次為固定因素，考察料液比對構樹葉多糖得率的影響。由圖2 可知，構樹葉多糖得率在一定范圍內(nèi)（1∶10～1∶40 g/mL）隨著溶劑的增加而增大，當料液比為1∶40～1∶60 g/mL時，多糖得率趨于穩(wěn)定，無明顯變化，表明多糖已基本溶出。

圖2 料液比對構樹葉多糖得率的影響

2.2.3 提取時間對構樹葉多糖得率的影響 以提取溫度100 ℃、料液比1∶40、提取1 次為固定因素。由圖3 可知，提取時間在0.5～2.0 h 構樹葉多糖的得率明顯增加，2.0～3.0 h趨于平緩，無明顯變化；4.0 h后稍微下降，可能是由于提取時間過長，雜質(zhì)溶出較多，從而影響多糖得率，因此選擇最佳提取時間2.0 h。

2.2.4 提取次數(shù)對構樹葉多糖得率的影響 以提取溫度 100 ℃、料液比 1∶40、提取時間 2.0 h 為固定因素，考察提取次數(shù)對構樹葉多糖得率的影響。由圖4 可知，當提取次數(shù)增加，構樹葉多糖得率可隨之增加；但提取2 次之后得率增加不明顯，逐漸趨于穩(wěn)定。由于提取次數(shù)過多，導致溶劑用量增多、耗能增大，因此選擇最佳提取次數(shù)為2 次。

圖3 提取時間對構樹葉多糖得率的影響

圖4 提取次數(shù)對構樹葉多糖得率的影響

2.3 響應面試驗

2.3.1 試驗結果 響應面試驗結果見表2。

2.3.2 回歸模型與方差分析 采用Design Expert 8.0 軟件對數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到構樹葉多糖得率（Y）對3 因素的回歸方程：

Y=8.07+0.29A+0.24B+1.05C-0.088AB-0.095AC-0.14BC-0.32A2-0.13B2-0.90C2。

由表3 結果可知，模型F為 748.97（P<0.000 1）、失擬項值為2.51（P>0.05），表明該模型顯著且擬合度良好，同時相關系數(shù)R2為0.999 0 及失擬項系數(shù)為0.997 6，表明試驗操作可信，理論預測可行。另外，由F可知，因素A、B、C及其交互項AB、AC、BC與二次項A2、B2、C2對構樹葉多糖得率均表現(xiàn)出極顯著性影響（P<0.01），順序依次為C>A>B。

2.3.3 響應面分析 通過模型繪制各因素的響應面與等高線（圖5），分析提取過程中不同因素的相互作用對構樹葉多糖得率的影響，由圖5 可知，料液比與提取時間、提取次數(shù)的響應面較陡峭、等高線趨于橢圓形，表明3 個因素間交互作用顯著。其中，隨著溶劑的增加，構樹葉多糖得率先增加后穩(wěn)定；隨著提取時間的延長、提取次數(shù)的增加，構樹葉多糖得率均先增加后略微下降。

表2 響應面試驗設計與結果

表3 回歸模型方差分析結果

2.3.4 最優(yōu)條件確定 由軟件分析所得最優(yōu)提取工藝條件為料液比1∶43.03（g/mL），提取時間2.57 h、提取2.52 次，預測構樹葉多糖得率的理論值為8.45%。結合實際情況修正為料液比1∶40（g/mL）、提取時間2.5 h、提取3次，該條件下多糖得率為（8.37±1.03）%，與理論預測值較為接近。

2.4 體外抗氧化活性評價

2.4.1 清除DPPH·作用 對DPPH·自由基清除率變化曲線進行線性回歸得到方程：構樹葉多糖Y=2.450X+43.57（R2=0.989），IC50為 2.62 mg/mL；VCY=2.285X+37.08（R2=0.988），IC50為 5.64 mg/mL。在 1～10 mg/mL 隨著濃度的增加，構樹葉多糖對DPPH·自由基的清除作用逐漸增強，且強于VC（圖6）。

圖5 不同因素交互作用對構樹葉多糖得率影響的響應面與等高線

圖6 不同樣品對DPPH·自由基清除作用

2.4.2 清除ABTS+·自由基 對ABTS+·自由基清除率變化曲線進行線性回歸得到方程：構樹葉多糖Y=702.1X+2.724（R2=0.982），IC50為 0.067 mg/mL；VCY=1 654.0X+26.29（R2=0.991），IC50為 0.014 mg/mL。在0.04～0.14 mg/mL 隨著濃度的提高，構樹葉多糖對ABTS+·自由基的清除作用逐漸增強，表明具有較強的清除作用，但弱于VC（圖7）。

2.4.3 清除·OH 自由基 對·OH 自由基清除率變化曲線進行線性回歸得到方程：構樹葉多糖Y=21.09X+30.17（R2=0.986），IC50為 0.94 mg/mL；VCY=112.80X+18.66（R2=0.986），IC50為 0.28 mg/mL。在0.1～2.5 mg/mL 隨著濃度的提高，構樹葉多糖對·OH自由基的清除作用逐漸增強，表明具有較強的清除作用，但弱于VC（圖8）。

圖7 不同樣品對ABTS+·自由基清除作用

圖8 不同樣品對·OH 自由基清除作用

圖9 不同質(zhì)量濃度樣品對·自由基清除能力

2.4.5 對鐵的還原力測定 由圖10 可知，在0.08～0.48 mg/mL 構樹葉多糖與VC 的還原力均隨質(zhì)量濃度的增大而提高，但是VC 的增幅更大；兩者相比，VC 還原力強于構樹葉多糖。

3 結論

采用加熱回流提取構樹葉多糖，通過Box-Behnken 響應面法進行優(yōu)化，同時進一步修正得到最佳提取工藝為提取溫度100 ℃、料液比1∶40（g/mL）、提取時間2.5 h、提取3 次，該條件下所得多糖得率為（8.37±1.03）%，稍低于理論值；表明模型具有較好的預測性，該優(yōu)化的工藝參數(shù)切實可行，適用于構樹葉多糖提取工藝的優(yōu)化。

圖10 不同樣品的還原能力

體外抗氧化活性結果表明，構樹葉多糖具有較強的清除DPPH·、ABTS+·、·OH 和·等自由基的活性，其中對DPPH·的作用強于VC，其他則弱于VC；對鐵的還原力與抗氧化能力表現(xiàn)出正相關性，且均呈現(xiàn)出良好的量效關系。構樹葉多糖可作為醫(yī)藥保健食品、美容護膚品等的新型天然抗氧化劑，其作用途徑及相關通路將進一步深入研究。