黃一龍，龐天德，史 靜，韋錦益，姚 娜

（廣西壯族自治區(qū)畜牧研究所，南寧 530001）

廣西地處中國(guó)南方亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，水熱同期，年均溫大于等于10 ℃，具有良好的植物生長(zhǎng)條件優(yōu)勢(shì)。但每年從5 月開始進(jìn)入高溫高濕氣候，致使很多暖溫帶地區(qū)生長(zhǎng)的優(yōu)質(zhì)牧草如苜蓿、黑麥草、紫云英等不能越夏，在廣西地區(qū)只能作為冬季牧草使用，使用時(shí)間短，每年都需要重復(fù)種植，極大地提高了種植成本，降低了使用效率。

大量的研究表明，植物的耐熱性與其自身代謝具有很大的關(guān)系［1］。高溫條件下，植株體內(nèi)會(huì)發(fā)生一系列生理變化，滲透調(diào)節(jié)能力降低，細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生與清除平衡被打破，抗氧化酶防御系統(tǒng)以及光合系統(tǒng)均會(huì)發(fā)生一系列變化，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育造成很大影響，甚至死亡［2-4］。近年來，應(yīng)對(duì)植物的高溫脅迫，除了篩選耐高溫品種以外，外源保護(hù)劑的應(yīng)用對(duì)熱應(yīng)激下的植物生長(zhǎng)也具有積極作用［1］。油菜素內(nèi)酯（Brassinolide，BR）是甾醇類植物生長(zhǎng)激素，活性高，具有較強(qiáng)的廣普性，現(xiàn)已被確認(rèn)為第6 類植物激素［5］。對(duì)植物逆境脅迫高溫、干旱、高鹽以及病害等具有抗性作用，能增強(qiáng)細(xì)胞的分裂和伸長(zhǎng)，促進(jìn)作物生長(zhǎng)，增強(qiáng)光合作用，提高生物產(chǎn)量，調(diào)節(jié)植物的生理代謝功能，提高抗逆性，保護(hù)植物免受逆境脅迫［6］。2，4-表油菜素內(nèi)酯（2，4-Epibrassinolide，EBR）作為人工合成的高活性油菜素內(nèi)酯類似物，被廣泛地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)［6，7］。在茶樹［7］、水稻［8］、花卉牡丹［5］、除蟲菊［9］以及番茄［10］、茄子［11］、龍須菜［12］、西葫蘆［6］等蔬菜應(yīng)對(duì)高溫脅迫的研究中有較多應(yīng)用，但在紫花苜蓿的耐熱性研究上鮮見報(bào)道。為此，試驗(yàn)運(yùn)用外源激素2，4-表油菜素內(nèi)酯對(duì)高溫脅迫下的紫花苜蓿（Medicago sativaL.）進(jìn)行抗高溫脅迫機(jī)理研究，探索外源激素調(diào)控紫花苜蓿的抗逆生理機(jī)制，提高抗熱性，降低高溫?fù)p害，延長(zhǎng)南方冬季型牧草的使用壽命，提高利用效率，以期解決暖溫帶的優(yōu)質(zhì)牧草在南方畜牧業(yè)的應(yīng)用及生產(chǎn)上的局限性問題。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

試驗(yàn)選擇紫花苜蓿WL525 為試驗(yàn)材料，購(gòu)于百綠（天津）草業(yè)有限公司。將紫花苜蓿栽種于花盆中，待長(zhǎng)至3 個(gè)月苗齡時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)基本一致的苜蓿幼苗放入人工氣候箱，置于人工智能氣候箱中模擬高溫環(huán)境脅迫。預(yù)培養(yǎng)15 d，光照度3 000 lx，晝/夜溫度25 ℃/15 ℃，濕度80%，光照12 h，黑暗12 h。試驗(yàn)設(shè) 0（對(duì)照）、0.05、0.10、0.50、1.00 mg/L 5 個(gè)梯度外源激素EBR濃度，其中對(duì)照噴施無菌水。1周后進(jìn)行葉面噴施外源激素處理。連續(xù)噴施3 d，第3 天噴施結(jié)束2 h 后，將溫度調(diào)節(jié)至?xí)?夜溫度42 ℃/30 ℃，光照、濕度及光照時(shí)間相同，分別于 0、3、6、12、24 h 后取樣（成熟葉片），放入液氮中速凍，再轉(zhuǎn)入-40 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫瑱z測(cè)樣本的脯氨酸含量、可溶性蛋白質(zhì)含量、過氧化物酶（POD）及超氧化物歧化酶（SOD）活性。

1.2 生理指標(biāo)測(cè)定

脯氨酸用磺基水楊酸溶液提取后，采用茚三酮比色法［13］進(jìn)行測(cè)定；可溶性蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)比色法［13］測(cè)定；POD 活性采用愈創(chuàng)木酚法［13］測(cè)定；SOD 活性采用氮藍(lán)四唑NBT 法［13］測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）表示，利用Excel軟件建立原始數(shù)據(jù)庫并制圖表，采用DPS 13.5 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)和多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫脅迫下EBR 對(duì)紫花苜蓿游離脯氨酸含量的影響

隨著高溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，不同處理的紫花苜蓿游離脯氨酸含量均呈上升趨勢(shì)。其中0.10 mg/L EBR 處理下游離脯氨酸含量上升最快，24 h 達(dá)到（59.85±10.65）μg/g，較對(duì)照提高了54.25%，其次為0.50 mg/L EBR 處理，24 h 游離脯氨酸含量為（57.55±7.50）μg/g，較對(duì)照提高了48.32%（圖1）。

圖1 EBR 對(duì)高溫脅迫下紫花苜蓿游離脯氨酸的影響

2.2 高溫脅迫下EBR 對(duì)紫花苜?？扇苄缘鞍踪|(zhì)含量的影響

高溫脅迫下，紫花苜蓿對(duì)照組可溶性蛋白質(zhì)含量呈先上升后下降的變化趨勢(shì)。但隨著EBR 的施用，可溶性蛋白質(zhì)含量在先上升再下降后又呈逐漸回升的趨勢(shì)，0.10 mg/L EBR 處理分別在 3、6、12 和24 h時(shí)均處于最高值，其中在12 h時(shí)達(dá)到28.55 mg/g，較對(duì)照組提高59.68%，差異顯著（P＜0.05）（圖2）。

圖2 EBR 處理對(duì)高溫脅迫下紫花苜蓿可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

2.3 高溫脅迫下EBR 對(duì)紫花苜?？寡趸x指標(biāo)的影響

在高溫脅迫下，不同濃度EBR 處理紫花苜蓿使其對(duì)抗氧化酶活性指標(biāo)呈現(xiàn)不同程度的變化。從POD 活性的變化規(guī)律來看，在高溫脅迫下3 h 內(nèi)POD 指標(biāo)具有較高活性，呈上升趨勢(shì)，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)活性逐漸降低。但在相同時(shí)間內(nèi)，EBR 處理能夠顯著提高POD 活性，其中，0.10 mg/L EBR 處理在高溫脅迫下POD 活性較對(duì)照提高了15.38%～63.99%（圖3）。從SOD 活性的變化規(guī)律來看，高溫脅迫下，紫花苜蓿SOD 活性呈先上升后下降的趨勢(shì)。在高溫脅迫處理0、3、6 h時(shí)，0.10 mg/L EBR 處理具有明顯優(yōu)勢(shì)，較對(duì)照組高出22.69%～38.66%；隨著高溫脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，12 h 和24 h 時(shí)，0.05 mg/L EBR 處理產(chǎn)生的SOD 活性最高，分別較對(duì)照高出15.64%和14.41%。

圖3 EBR 處理對(duì)高溫脅迫下紫花苜蓿POD 活性的影響

圖4 EBR 處理對(duì)高溫脅迫下紫花苜蓿SOD 活性的影響

3 小結(jié)與討論

夏季高溫是直接影響紫花苜蓿生長(zhǎng)發(fā)育的主要生態(tài)環(huán)境因素之一。在高溫的脅迫下，紫花苜蓿生長(zhǎng)發(fā)育受阻，體內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸與光合系統(tǒng)遭受破壞，多個(gè)抗氧化酶活性下降，生理代謝失衡，抗旱、抗病蟲害的能力也隨之下降［14，15］。高溫再伴隨著病蟲害的發(fā)生，紫花苜蓿就會(huì)生長(zhǎng)緩慢，枯萎甚至死亡。紫花苜蓿在受到高溫脅迫后，自身也會(huì)對(duì)脅迫產(chǎn)生一系列的應(yīng)對(duì)反應(yīng)，主要體現(xiàn)在細(xì)胞膜系統(tǒng)、滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)、抗氧化系統(tǒng)和光合系統(tǒng) 4 個(gè)方面［4，15］。其中，脯氨酸作為植物的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，主要起到平衡原生質(zhì)與環(huán)境的滲透功能，保持植物膜結(jié)構(gòu)的完整性，在正常情況下含量較少，但會(huì)隨著外來脅迫逐漸積累，對(duì)植物的滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)進(jìn)行保護(hù)，是抵御外界脅迫的重要信號(hào)之一。試驗(yàn)中，噴施EBR 溶液使紫花苜蓿體內(nèi)的游離脯氨酸含量較對(duì)照有明顯提升，且隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，噴施濃度為0.10 mg/L效果最佳，由此可見，噴施EBR 溶液可以在高溫逆境中促進(jìn)脯氨酸的積累，改善細(xì)胞膜透性，與王震等［6］在2，4-表油菜素內(nèi)酯應(yīng)對(duì)高溫脅迫下的西葫蘆幼苗生理及光合特性研究以及高健等［8］在2，4-表油菜素內(nèi)酯緩解水稻花期高溫脅迫的生理機(jī)制研究中結(jié)果一致。

可溶性蛋白質(zhì)也是植物在逆境中應(yīng)對(duì)脅迫的重要標(biāo)志之一。它具有較強(qiáng)的親水力，隨著脅迫大量產(chǎn)生，保護(hù)細(xì)胞膜，明顯增加細(xì)胞親水力、原生質(zhì)彈性以及束縛水含量，調(diào)節(jié)平衡細(xì)胞與環(huán)境的滲透壓，從而緩解高溫等對(duì)植物的傷害［16，17］。本試驗(yàn)中，外源EBR 對(duì)紫花苜?？扇苄缘鞍踪|(zhì)的累積具有顯著的作用效果，且隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)差異明顯，說明外源EBR 能夠通過迅速積累提高可溶性蛋白質(zhì)含量，增加紫花苜蓿的細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)作用，提高植物的抗高溫能力。這與吳雪霞等［11］在外源EBR 對(duì)高溫脅迫下茄子幼苗生長(zhǎng)中可溶性蛋白的研究以及任增斌等［5］在外源EBR 對(duì)于牡丹耐熱性中可溶性蛋白質(zhì)的研究結(jié)果一致。

高溫脅迫下，植物細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的自由基，脂膜發(fā)生過氧化現(xiàn)象，正常的生理代謝功能遭受損害［4］。此時(shí)，植物會(huì)通過一定的酶學(xué)機(jī)制來抵御或修復(fù)逆境對(duì)細(xì)胞所造成的傷害，從而保護(hù)植物體的正常生長(zhǎng)。其中過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）等就可以通過調(diào)節(jié)其活性，來清除高溫脅迫所帶來的過剩自由基和活性氧，保護(hù)自身細(xì)胞免受氧化傷害。而通過外源激素EBR的處理，能夠進(jìn)一步的提高POD 和SOD 的活性，緩解高溫脅迫所帶來的傷害，在李志鑫等［7］利用外源激素EBR 誘導(dǎo)茶樹耐熱性生理機(jī)制研究和華智銳等［18］在小麥幼苗抗旱性的誘導(dǎo)效應(yīng)研究結(jié)果中均可以看出。本試驗(yàn)中EBR 對(duì)高溫脅迫下紫花苜蓿的POD 和SOD 活性均較對(duì)照有明顯的提高，且保持較高的活性程度，說明EBR 對(duì)高溫脅迫下的紫花苜蓿酶反應(yīng)機(jī)制敏感，且效果比較理想，緩解了高溫脅迫對(duì)紫花苜蓿的傷害。

綜合分析來看，外源2，4-表油菜素內(nèi)酯作為一種高活性的植物激素，對(duì)高溫脅迫下的紫花苜蓿具有一定的保護(hù)作用，能夠降低高溫對(duì)紫花苜蓿滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)的傷害，提高紫花苜蓿的耐熱性，其中以0.10 mg/L 效果最好，為紫花苜蓿的抗高溫栽培提供了基礎(chǔ)理論依據(jù)。