黃 菁，汪宗清，陳 晨，湯小虎

(1.南京中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，江蘇 南京 210000； 2.昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院/云南省腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)結合科，云南 昆明 650118； 3.云南中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，云南 昆明 650000； 4.云南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院風濕科，云南 昆明 650000)

桂枝為樟科植物肉桂的干燥嫩枝，具有發(fā)汗解表、溫通經(jīng)脈和通陽化氣的功效。在溫通經(jīng)脈方面，《神農(nóng)本草經(jīng)》謂之“利關節(jié)”“為諸藥先聘通使”；《本草思辨錄》中總結，“桂枝所優(yōu)，在溫經(jīng)通脈，內外證咸宜”，皆說明桂枝具有溫通經(jīng)脈之效[1]。現(xiàn)代藥理研究結果表明，桂枝具有擴血管[2]、解熱[3]、鎮(zhèn)痛抗炎[4]、鎮(zhèn)靜和抗驚厥[5]、抗過敏[6]、抗菌[7]以及抗病毒[8]等作用。

附子為毛茛科植物烏頭的側根。附子始見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為“下品”。附子具有回陽救逆、助陽補火、散寒止痛和祛風散邪的功效。在散寒止痛方面，《神農(nóng)本草經(jīng)》記載，附子“治痿躄，拘攣，膝痛不能步行”。附子既能散寒除濕，又能祛風，為蠲痹之要藥，如《本經(jīng)逢原》記載，“附子氣味俱厚而辛烈，能通行十二經(jīng)，無所不至”?，F(xiàn)代藥理研究結果表明，附子具有強心[9]、擴血管[10]、抗休克、抗心律失常[11]和心肌保護作用[12]。

桂枝性溫味辛，辛則發(fā)散，溫則能通，散在表之風寒濕邪而宣通痹痛，善治各種痹阻于肌肉經(jīng)絡骨節(jié)的疼痛。附子性大熱，味辛、甘，其用走而不守，通行十二經(jīng)。桂枝、附子兩藥相須為用，強于溫散，臟腑經(jīng)絡和四肢百骸之風寒濕邪均可溫散除之。中藥是多成分、多靶點及多種成分間協(xié)同作用的復雜體系。網(wǎng)絡藥理學是以中醫(yī)整體觀為指導的中藥研究方法，遵循系統(tǒng)論和還原論相結合、宏觀和微觀相結合的方法，以系統(tǒng)生物學和網(wǎng)絡生物學為主要技術支撐，結合現(xiàn)代藥理學研究成果，對中藥進行多層次系統(tǒng)研究，全面揭示中藥多成分、多靶點、多通路的整體協(xié)同作用，這與類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)發(fā)病與遺傳、環(huán)境及激素等多因素交互作用的復雜發(fā)病機制相契合。本研究基于網(wǎng)絡藥理學方法，探討了“桂枝-附子”溫通經(jīng)脈配伍治療RA的作用機制。

1 資料與方法

1.1 化學成分的構建與篩選

基于中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php),分別檢索桂枝(Cinnamomi Ramulus)、附子(Aconiti Lateralis Radix Praeparata)的所有化學成分。

1.2 中藥成分靶點獲取

基于TCMSP，分別檢索桂枝和附子的全部靶點。

1.3 疾病靶點獲取

在GeneCards數(shù)據(jù)庫，以“Rheumatoid arthritis”為檢索詞進行檢索。

1.4 獲取藥物靶點和疾病靶點交集

利用Bioinformatics & Evolutionary Genomics 線上軟件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)，構建化合物與疾病交集靶點韋恩圖。

1.5 構建“桂枝附子配伍-化學成分-靶點-RA”網(wǎng)絡

基于“桂枝-附子”化學成分信息、化學成分與RA交集靶點信息以及二者的對應關系，利用Cytoscape 3.6.0 軟件，繪制“桂枝附子配伍-化學成分-靶點-RA”網(wǎng)絡圖。

1.6 構建藥物靶點-疾病靶點間蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡

使用STRING 11.0在線軟件，構建“化學成分-疾病”的PPI網(wǎng)絡，挖掘該調控網(wǎng)絡的核心靶點。

1.7 基因本體(gene ontology, GO)功能富集分析和基于京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)的通路富集分析

采用David Bioinformatics Resources 6.8數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)，對“桂枝-附子”溫通經(jīng)脈配伍活性成分潛在靶點網(wǎng)絡中的蛋白進行GO功能富集分析和基于KEGG的生物通路富集分析。

2 結果

2.1 篩選化合物基本信息

基于TCMSP檢索到桂枝的化學成分220個，附子的化學成分65個。按口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%和類藥性(drug-likeness, DL)≥0.18作為化學成分篩選條件，得到桂枝7個化學成分，附子21個化學成分，見表1。

2.2 中藥成分靶點信息

基于TCMSP檢索得到桂枝的化學成分靶點2 402個，附子化學成分靶點139個。

2.3 疾病靶點信息

檢索得到RA疾病靶點920個，其中相關度>50的疾病靶點見表2。

2.4 化合物靶點和疾病靶點交集信息

化合物與疾病交集靶點韋恩圖見圖1，得到交集靶點16個，靶點信息見表3。

2.5 構建“桂枝附子配伍-化學成分-靶點-RA”網(wǎng)絡

“桂枝附子配伍-化學成分-靶點-RA”網(wǎng)絡圖見圖2。

2.6 構建PPI網(wǎng)絡

“化學成分-疾病”的PPI網(wǎng)絡見圖3；該調控網(wǎng)絡的核心靶點和節(jié)點度值見表4。

2.7 GO富集分析和KEGG通路富集分析

GO功能富集分析結果見圖4；KEGG通路富集分析結果見表5、圖5。

表1 桂枝-附子配伍化合物基本信息

表2 相關度>50的疾病靶點

圖1 化合物與疾病交集靶點韋恩圖

表3 化合物與疾病交集靶點名稱

圖2 “桂枝附子配伍-化學成分-靶點-RA”網(wǎng)絡圖

3 討論

桂枝辛溫發(fā)散，其入藥部位為枝條，可通達四肢，溫通經(jīng)脈，宣通痹痛。配伍附子相須為用，則可增強桂枝溫散之力。《本草備要》總結了附子的功效，其“逐風寒濕。辛甘有毒、大熱純陽，其性浮而不沉、其用走而不守，通行十二經(jīng)，無所不至。同桂枝溫經(jīng)散寒”，附子溫通內外，溫達臟腑經(jīng)絡、四肢百骸，凡入侵機體的風寒濕邪，痹阻四肢經(jīng)絡骨節(jié)，出現(xiàn)疼痛、麻木及

圖3 “化學成分-疾病”PPI網(wǎng)絡圖

表4 “化學成分-疾病”PPI網(wǎng)絡的核心靶點和節(jié)點度值

表5 KEGG富集結果

關節(jié)屈伸不利之癥，均可應用“桂枝-附子”這一配伍結構施治取效[1]。本研究按照網(wǎng)絡藥理學研究思路，在TCMSP分別檢索桂枝和附子的化學成分，按OB≥30%和DL≥0.18篩選、去重后得到27個化學成分。再次基于TCMSP分別檢索桂枝和附子化學成分靶點，去重后得到桂枝的化合物靶點660個，附子的化合物靶點7個，合計667個靶點，兩藥的交集靶點61個，體現(xiàn)出桂枝-附子配伍具有多靶點作用且共享多個靶點的特征，也體現(xiàn)出二者相須為用的特點。通過構建“桂枝-附子”配伍的化合物靶點與疾病靶點的交集(見圖1)，發(fā)現(xiàn)化合物與疾病靶點聚焦在16個基因上：SLC6A4、CHEK1、BCL2、ICAM1、CASP8、CA2、PGR、CASP9、CAT、PTGS2、CHRM3、PTGS1、JUN、BAX、CASP3及HSP90AA1(見表3)。其中，BCL2通過誘導(促凋亡)或抑制(抗細胞凋亡)來調節(jié)細胞死亡(細胞凋亡)。BAX與BCL2形成異二聚體，起到凋亡激活劑的作用。BAX與BCL2的關聯(lián)和比例也決定了細胞凋亡后細胞的存活或死亡。BCL2的表達受腫瘤抑制基因p53調控，并已顯示出與p53介導的細胞凋亡有關。ICAM1編碼內皮細胞和免疫系統(tǒng)細胞上表達的細胞表面糖蛋白，與CD11a/CD18或CD11b/CD18類型的整合素結合。CASP8、CASP9及CASP3編碼的蛋白質是半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶，在細胞凋亡的執(zhí)行階段起著關鍵作用，通過參與Fas和各種凋亡刺激誘導的程序性細胞死亡。CA2編碼的蛋白質可催化二氧化碳的可逆水合。該酶的缺陷與骨質疏松和腎小管酸中毒有關。CAT編碼過氧化氫酶，是機體抵抗氧化應激的關鍵抗氧化劑。過氧化氫酶將活性過氧化氫轉化為水和氧氣，從而減輕了過氧化氫的毒性作用。氧化應激被認為在許多慢性或遲發(fā)性疾病的發(fā)展中起著作用，如哮喘、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、風濕性關節(jié)炎和惡性腫瘤[13]。CAT的多態(tài)性與過氧化氫酶活性的降低有關[14]。PTGS1、PTGS2是前列腺素生物合成中的關鍵酶，涉及炎癥和有絲分裂的前列腺素類生物合成[15]。

利用Cytoscape 3.6.0軟件構建的“桂枝附子配伍-化學成分-靶點-RA”網(wǎng)絡，通過網(wǎng)絡分析，計算出度值較高的化合物/靶點，依次為：MOL000358(beta-sitosterol，β-谷甾醇)，度值為13；PTGS2，度值為10；PTGS1，度值為9；HSP90AA1，度值為7；MOL004576(taxifolin，二氫槲皮素)、MOL000492[(+)-catechin，兒茶素]、MOL002388(Delphin_qt，石防風素)及PGR，度值均為5。

圖4 GO功能富集分析結果

圖5 KEGG通路富集分析結果

在PPI網(wǎng)絡中，有16個節(jié)點，代表16個靶基因；47條邊，代表靶基因間47條關聯(lián)；PPI富集度P值為1.33×10-15；平均節(jié)點度值為5.88。采用David Bioinformatics Resources 6.8數(shù)據(jù)庫對“桂枝-附子”溫通經(jīng)脈配伍活性成分潛在靶點網(wǎng)絡中的蛋白進行GO功能富集分析，結果顯示，該配伍主要影響半胱氨酸型內肽酶活性參與凋亡過程、過氧化物酶活性、作用于過氧化物的氧化還原酶活性、BH域結合、死亡域結合、抗氧化活性、死亡受體結合、泛素蛋白連接酶結合、泛素樣蛋白連接酶結合、半胱氨酸型內肽酶活性、血紅素結合、四吡咯結合、半胱氨酸型肽酶活性、腫瘤壞死因子受體超家族結合、神經(jīng)遞質結合、支架蛋白結合、銨離子結合、雙加氧酶活性、蛋白酶結合及內肽酶活性過程。

基于KEGG生物通路富集分析進行通路富集，結果顯示，富集程度較高的前15條通路依次為：癌癥通路、乙型肝炎、肌萎縮性側索硬化癥、凋亡、結直腸癌、p53信號通路、TNF信號通路、結核、病毒致癌、病毒性心肌炎、弓形蟲病、5-羥色胺能突觸、非酒精性脂肪性肝病、亨廷頓舞蹈病、HTLV-I 感染。說明“桂枝-附子”溫通經(jīng)脈配伍的多通路、多途徑作用潛在影響了RA的信號轉導和疾病進程。在TNF信號通路中，桂枝-附子溫通經(jīng)脈配伍可能通過上調CASP8進一步上調CASP3而促進細胞凋亡，同時影響AP-1的表達而干擾DNA上調細胞間信號、影響轉錄因子JUN的表達、促進細胞黏附和炎癥介質的合成。本研究從網(wǎng)絡藥理學角度預測了“桂枝-附子”溫通經(jīng)脈配伍治療RA可能的信號通路，為后續(xù)機制研究奠定了一定的基礎。