莫華秀，朱鎮(zhèn)華，鄧晗薇，賓 驥，李凡成

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一中醫(yī)臨床學(xué)院，湖南 長沙 410208； 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科，湖南 長沙 410007)

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是易感機(jī)體接觸致敏原后產(chǎn)生的由免疫球蛋白E(IgE)介導(dǎo)的，以突然和反復(fù)發(fā)作的打噴嚏、鼻塞、鼻流清涕和鼻癢等為主要癥狀的鼻部黏膜慢性炎癥反應(yīng)[1]。AR的特點(diǎn)是治療周期長、發(fā)作反復(fù)、難以治愈等，臨床上易出現(xiàn)鼻部及眼部的伴隨癥狀。近年來，流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，全球AR患病率逐年升高，約為10%～40%[2-3]。根據(jù)美國2015年AR臨床指南的相關(guān)索引[4]，避免接觸過敏原、藥物治療、手術(shù)治療及特異性免疫治療是臨床上較為常見的治療手段，其中應(yīng)用廣泛的一線治療藥物是鼻用糖皮質(zhì)激素和第2代鼻用或口服抗組胺藥，雖然其起效較快，但從長期的治療結(jié)果看，其不僅存在易復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)期效果難以保證等缺點(diǎn)[5]，還使得機(jī)體的敏感性降低，從而可能引發(fā)不良反應(yīng)[6-7]。中醫(yī)對AR的治療是基于患者的整體，糾正機(jī)體陰陽失衡的疾病狀態(tài)，從而提高機(jī)體的免疫功能。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，該病多因肺脾腎的虛損，風(fēng)寒之邪乘虛入侵所致，故用鼻敏片治以溫肺祛風(fēng)、補(bǔ)腎健脾、攝津止涕，長期臨床應(yīng)用的療效顯著。本研究旨在以寒證AR豚鼠模型為研究對象，通過檢測豚鼠血清中IgE、白細(xì)胞介素(IL)17和IL-10的含量，鼻黏膜中輔助性T細(xì)胞17(Th17)/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)、特異性轉(zhuǎn)錄因子維甲酸相關(guān)孤兒受體γt(RORγt)和叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(Foxp3)蛋白的表達(dá)水平，探討Th17/Treg細(xì)胞的免疫機(jī)制，為臨床上應(yīng)用鼻敏片治療AR提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑：雞卵清蛋白(索萊寶生物公司，貨號：1031H052)；氫氧化鋁[Al(OH)3](Thermo Fisher公司，貨號：PF201964)；豚鼠IgE、IL-10和IL-17酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(上海晶天生物公司，貨號：20190729)；兔抗豚鼠Foxp3蛋白多克隆抗體(bioss公司，貨號：BS-10211R)；兔抗豚鼠RORG蛋白多克隆抗體(bioss公司，貨號：BS-6217R)；氯雷他定片(上海拜耳醫(yī)藥有限公司，批準(zhǔn)文號為國藥準(zhǔn)字H10970410，批號為JS08187)；鼻敏片由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物：普通級雄性英國種豚鼠40只，體重250～350 g[湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，動物批號：SCXK(湘)2014-0010]；正常飼料飲食外給予包菜或胡蘿卜。

1.2 方法

1.2.1 造模及給藥：將40只豚鼠隨機(jī)分為4組，即模型組、氯雷他定片組、鼻敏片組和空白組。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，前3組以復(fù)方?jīng)鏊?卵清蛋白(OVA)致敏法復(fù)制寒證AR模型，空白組正常飼養(yǎng)。參照陳小野等[8]改良后的復(fù)方寒涼藥制備寒證模型，采用黃柏-知母-生石膏-龍膽草(質(zhì)量比為1.5∶2∶1∶1.2)煎制成200%(濃度)的水煎劑灌胃(10 ml/kg)，1只1次4 ml，1日3次，于第17日起改為1日4次灌胃給藥，用藥28 d。參照AR動物模型(草案)制備豚鼠模型[9]，按卵清蛋白30 mg+[Al(OH)3]3 g+0.9%氯化鈉溶液100 ml配制混懸液，每只豚鼠隔日腹腔注射1 ml，共行7次基礎(chǔ)致敏。配制2%卵清蛋白(卵清蛋白)0.9%氯化鈉溶液，用移液槍進(jìn)行雙側(cè)滴鼻激發(fā)，1個鼻孔1次50 μl，1日1次，共行7次滴鼻激發(fā)。造模成功后，隔日給予卵清蛋白(卵清蛋白)1 g/L滴鼻以維持模型。造模后，按體表面積法計(jì)算給藥劑量，氯雷他定片組豚鼠的給藥劑量為0.903 mg/kg，鼻敏片(組方：黃芪20 g，白術(shù)10 g，防風(fēng)6 g，麻黃5 g，當(dāng)歸10 g，細(xì)辛3 g，巴戟天10 g，淫羊藿10 g，蟬蛻6 g，五味子6 g，白芍10 g，甘草6 g，白蒺藜10 g)組豚鼠的給藥劑量為10.117 g/kg，其余兩組豚鼠給予0.9%氯化鈉溶液4 ml，均灌胃給藥，治療15 d，每日分2次給藥。

1.2.2 血清、鼻黏膜的采集及檢測方法：用10%水合氯醛溶液(0.1 ml/20 g)麻醉后心臟采血，以3 000 r/min(離心半徑為13.5 cm)離心15 min后取血清，并用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定其血清IgE、IL-10及IL-17的含量。取一側(cè)鼻黏膜于4%多聚甲醛溶液固定后，經(jīng)石蠟包埋切片，行蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察其病理組織形態(tài)。另取一側(cè)完整鼻中隔及黏膜放入Eppendorf管，并移入-80 ℃低溫冰箱保存待行Western blot法測定鼻黏膜中RORγt、Foxp3蛋白的表達(dá)。

1.2.3 豚鼠行為學(xué)評價：依據(jù)《實(shí)用中醫(yī)證候動物模型學(xué)》《中醫(yī)虛證診斷標(biāo)準(zhǔn)》等對寒證模型復(fù)制是否成功進(jìn)行評價[8，10]。寒證動物模型表現(xiàn)為畏寒，活動減弱，攝食、飲水量降低，耳廓、爪趾顏色淡(白)，舌唇淡(白)等癥狀。參照相關(guān)文獻(xiàn)[11]，對其鼻部癥狀進(jìn)行疊加量化法評分，其行為學(xué)總分>5分表示造模成功。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 四組豚鼠治療前后鼻部癥狀評分比較

治療前后癥狀評分結(jié)果顯示，治療前，與空白組比較，模型組、氯雷他定片組及鼻敏片組豚鼠鼻部癥狀評分均顯著升高，差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；治療15 d后，與模型組比較，氯雷他定片組、鼻敏片組豚鼠鼻部癥狀評分顯著降低，差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；組間比較，氯雷他定片組、鼻敏片組豚鼠鼻部癥狀評分的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 四組豚鼠治療前后鼻部癥狀評分比較分)

2.2 四組豚鼠治療后血清IgE、IL-10及IL-17水平比較

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)結(jié)果顯示，治療后，與空白組比較，模型組豚鼠血清IgE、IL-17含量明顯升高，血清中IL-10含量明顯降低，差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，氯雷他定片組、鼻敏片組豚鼠血清IgE含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，血清IL-10的表達(dá)水平明顯升高，而血清中IL-17的表達(dá)水平明顯降低，差異均有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；組間比較，氯雷他定片組、鼻敏片組豚鼠IgE、IL-10及IL-17水平的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 四組豚鼠治療后血清IgE、IL-10及IL-17水平比較

2.3 四組豚鼠治療后鼻黏膜Foxp3和RORγt的相對表達(dá)量比較

以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為內(nèi)參，其表達(dá)相對值用各條帶的灰度值與GAPDH比值表示。結(jié)果顯示，治療后，與空白組比較，模型組豚鼠鼻黏膜Foxp3蛋白表達(dá)明顯降低，模型組豚鼠RORγt表達(dá)明顯升高，差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，氯雷他定片組、鼻敏片組豚鼠鼻黏膜Foxp3表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而RORγt表達(dá)明顯降低，差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。組間比較，氯雷他定片組、鼻敏片組豚鼠Foxp3、RORγt表達(dá)量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3、圖1。

表3 四組豚鼠治療后鼻黏膜Foxp3和RORγt的相對表達(dá)量比較

圖1 Western Blot檢測豚鼠黏膜RORγt與Foxp3的表達(dá)

2.4 四組豚鼠鼻黏膜組織病理檢查結(jié)果

光鏡下豚鼠鼻黏膜病理檢查結(jié)果顯示，模型組豚鼠鼻黏膜上皮結(jié)構(gòu)紊亂，黏膜水腫，組織間隙出血或伴血管擴(kuò)張充血，間質(zhì)中大量炎癥細(xì)胞浸潤明顯；空白組豚鼠鼻黏膜上皮組織結(jié)構(gòu)完整，未見擠壓變形的炎癥細(xì)胞等；治療后，與模型組比較，氯雷他定片組、鼻敏片組豚鼠鼻黏膜炎癥反應(yīng)明顯減輕，見圖2。

A.模型組；B.氯雷他定片組(治療后)；C.鼻敏片組(治療后)；D.空白組A.model group; B.claritin group(after treatment); C.Bimin tablets group(after treatment); D.blank group

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，AR屬“鼽嚏”“鼻鼽”范疇?！杜K象》曰：“肺開竅于鼻，肺屬金、腎屬水、金水同源?！薄夺t(yī)法圓通·鼻流清涕·卷一》曰：“鼻流清涕一證，有從外感而致者，有從內(nèi)傷而致者，從外感而致者，感受外來之客邪，客于肺經(jīng)，閉其清道，肺氣不得下降，清涕是出……從內(nèi)傷而得者，由心肺之陽不足，不能統(tǒng)攝津液，而清涕出，腎絡(luò)通于肺，腎陽衰而陰寒內(nèi)生，不能收束津液，而清涕亦出?！盵12]認(rèn)為本病是由肺脾腎三臟功能的虛損，風(fēng)寒之邪氣乘虛侵入而致的本虛標(biāo)實(shí)證，肺氣虛則衛(wèi)表不固，腠理疏松，風(fēng)寒之邪氣乘虛侵入累及于鼻，邪氣客于肌表，而使陽氣壅滯于內(nèi)無法泄越，故見噴嚏外出而為嚏；且寒邪之氣壅肺，使其失于清肅，鼻竅不通故為鼽[13]。根據(jù)其病因病機(jī)特點(diǎn)，結(jié)合現(xiàn)代藥理學(xué)成果，得到經(jīng)驗(yàn)方鼻敏片，以益氣固表、祛風(fēng)散邪的玉屏風(fēng)散配合溫肺腎陽、祛散風(fēng)寒的麻黃附子細(xì)辛湯，并加健脾攝津止涕的藥物化裁而成，可標(biāo)本同治?，F(xiàn)代藥理研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，麻黃中的槲皮素有消炎、抗過敏及抗病毒等作用，且可抑制免疫反應(yīng)[14]；細(xì)辛揮發(fā)油的消炎、抗真菌及抗過敏等特性，可減輕AR的臨床癥狀[15]；黃芪多糖可促進(jìn)抗體生成以調(diào)節(jié)免疫[16]；白術(shù)多糖能活化T淋巴細(xì)胞以調(diào)節(jié)其免疫[17]；防風(fēng)多糖在抑制黏膜的炎癥反應(yīng)方面收效顯著，可調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答[18]。

既往研究結(jié)果表明，AR屬IgE介導(dǎo)的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)，其發(fā)病機(jī)制研究主要集中在Th1/Th2細(xì)胞失衡方面，認(rèn)為其發(fā)病是因Th1/Th2細(xì)胞失衡而使Th2細(xì)胞的表達(dá)增多，從而表現(xiàn)出以嗜酸粒細(xì)胞浸潤為主的炎癥反應(yīng)[19]。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)其發(fā)病還與Th17、Treg的免疫失衡密切相關(guān)，進(jìn)一步為AR的治療機(jī)制研究提供了新的思路[20]。研究結(jié)果表明，Th17、Treg在CD4+T細(xì)胞的基礎(chǔ)上進(jìn)行分化，且在功能表現(xiàn)上相互制約，從而維持機(jī)體免疫狀態(tài)的穩(wěn)態(tài)[21-22]。其中，RORγt是Th17細(xì)胞獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄因子，F(xiàn)oxp3是Treg細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)可在一定程度上反映Th17、Treg細(xì)胞的功能變化和狀態(tài)[23-24]。Th17細(xì)胞可分泌IL-17、IL-6、粒細(xì)胞集落刺激因子、趨化因子CXCL1、趨化因子CXCL5及基質(zhì)金屬蛋白酶等，使中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞不斷聚集，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥細(xì)胞發(fā)生浸潤、組織遭受嚴(yán)重破壞，從而參與機(jī)體免疫的系統(tǒng)調(diào)控[25-26]。Treg細(xì)胞通過分泌IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子β等抑制炎癥的因子，使得Th2細(xì)胞的活性降低，IgE的合成減少，并使嗜酸性粒細(xì)胞及細(xì)胞因子的募集、活化功能減弱，從而使其變態(tài)反應(yīng)性炎癥癥狀得到緩解[27]。

本研究結(jié)果顯示，鼻敏片對于鼻部炎癥所致黏膜水腫有著較為明顯的療效，且可降低血清中IgE的含量，減輕豚鼠噴嚏、流涕及抓鼻的鼻部癥狀，從而達(dá)到治療AR豚鼠的目的。鼻敏片可顯著升高血清IL-10水平，降低血清中IL-17的表達(dá)，從而糾正Th17/Treg細(xì)胞的失衡，緩解免疫炎癥反應(yīng)，其可能通過增強(qiáng)Foxp3蛋白的表達(dá)，抑制RORγt蛋白的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞的失衡。