周冰燚 徐珊珊 顧 恒 李銘臻 鄭立新

廣東省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)男性生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510600

短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeats，STR）是一類(lèi)微衛(wèi)星DNA，其核心序列的重復(fù)單位一般為2～7 bp，重復(fù)10～70 次。由于其多態(tài)性高，個(gè)體識(shí)別能力強(qiáng)，STR 分型結(jié)果準(zhǔn)確可靠、檢測(cè)靈敏和可重復(fù)性好，故在法醫(yī)學(xué)親子鑒定、個(gè)體識(shí)別及遺傳病連鎖分析等方面應(yīng)用廣泛[1-3]。STR 基因座突變率是評(píng)估遺傳標(biāo)記穩(wěn)定性和親子鑒定可靠性的指標(biāo)，不同基因座的突變率不同。STR 遺傳標(biāo)記發(fā)生突變，表現(xiàn)為可能的親屬之間顯著的遺傳不一致性，可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的否定親權(quán)關(guān)系，增加錯(cuò)判風(fēng)險(xiǎn)。因此，案件鑒定中在計(jì)算累積親權(quán)指數(shù)時(shí)需考慮突變問(wèn)題[4]。本研究應(yīng)用人類(lèi)STRtyper-21G 擴(kuò)增熒光檢測(cè)體系對(duì)本中心2016 年1 月—2019 年12 月的587 例親子鑒定案例的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，評(píng)價(jià)其在親子鑒定中的應(yīng)用價(jià)值，并探討了STR基因座的突變現(xiàn)象、突變率及突變特征等。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2016 年1 月—2019 年12 月587 例親子鑒定案例的1628 份樣本，均來(lái)自廣東省計(jì)劃生育專(zhuān)科醫(yī)院法醫(yī)物證鑒定中心的日常工作檢案。檢材包括血痕和帶毛囊的毛發(fā)。

1.2 檢測(cè)方法

案件樣本采用Chelex-100 法提取基因組DNA，用人類(lèi)STRtyper-21G 擴(kuò)增熒光檢測(cè)試劑盒（寧波海爾施基因科技有限公司）擴(kuò)增體系擴(kuò)增后在ABI3500平臺(tái)上應(yīng)用GeneMapperID-X1.3 軟件進(jìn)行STR 分型，該體系共檢測(cè)20 個(gè)常染色體基因座（D3S1358、TH01、D21S11、D18S51、Penta E、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、Penta D、vWA、D8S1179、TPOX、FGA、D19S433、D12S391、D6S1043、D2S1338、D1S1656及1個(gè)性別基因座Amelogenin）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

案例根據(jù)親權(quán)鑒定技術(shù)規(guī)范（GB-T 37223-2018）計(jì)算親權(quán)指數(shù)（PI）和累積親權(quán)指數(shù)（CPI）。本研究采用Excel 軟件對(duì)突變基因座的數(shù)量、突變來(lái)源、突變步數(shù)及重復(fù)單位的增加或減少進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，根據(jù)直接計(jì)數(shù)法得出相應(yīng)STR 基因座突變率，計(jì)算公式：STR 基因座的突變率=突變STR 基因座例數(shù)/（雙親案例數(shù)×2+單親案例數(shù)）。

2 結(jié)果

2.1 鑒定案例排除情況

587 例親子鑒定案件中排除30 例，占5.11%，包括11 例三聯(lián)體和19 例二聯(lián)體，均為多基因座排除，且都在3 個(gè)基因座以上。各基因座作為排除基因座的概率見(jiàn)表1。本文應(yīng)用的STR 檢測(cè)體系中只有D21S11 位點(diǎn)未在排除基因座內(nèi)。

表1 各基因座作為排除基因座的概率（n=30）

2.2 鑒定案例認(rèn)定情況及STR 基因座突變分析

587 例親子鑒定案件中認(rèn)定557 例，占94.89%，其中三聯(lián)體（母-子-父）443 例，二聯(lián)體（父-子或母-子）114 例，共1000 次減數(shù)分裂。STR 基因座突變情況分析見(jiàn)表2。其中19 例案件觀察到在20 個(gè)常染色體基因座中的13 個(gè)位點(diǎn)發(fā)生20 次突變，以vWA 和D12S391 位點(diǎn)突變率最高（0.0003），在7 個(gè)位點(diǎn)（TH01、D13S317、CSF1PO、Penta D、TPOX、FGA 和D2S1338）中沒(méi)有發(fā)生突變。一步突變19 次，表現(xiàn)為10 次減少1 個(gè)重復(fù)單位，8 次增加1 個(gè)重復(fù)單位，1 次不確定增加或者減少1 個(gè)重復(fù)單位；兩步突變1 次，表現(xiàn)為減少2 個(gè)重復(fù)單位。本研究統(tǒng)計(jì)16 次突變來(lái)源于父系，2 次突變來(lái)源于母系，2 次突變不能確定來(lái)源于母系或者父系；父源突變與母源突變的比例為8∶1。

表2 21 個(gè)STR 基因座突變情況統(tǒng)計(jì)分析（n=557）

3 討論

本研究采用人類(lèi)STRtyper-21G 擴(kuò)增熒光檢測(cè)體系進(jìn)行檢測(cè)，587 例親子鑒定案例中認(rèn)定557 例（94.89%），且認(rèn)定案例的CPI 指數(shù)均大于10 000，提示該系統(tǒng)的結(jié)果能夠達(dá)到認(rèn)定要求；排除30 例（5.11%），提示該21 個(gè)STR 基因座具有較高的非父排除能力。本研究案例只檢測(cè)STR 分型，提供基因座長(zhǎng)度和數(shù)量的變化情況，特殊案例或復(fù)雜親緣關(guān)系鑒定可補(bǔ)充檢測(cè)STR 位點(diǎn)及借助測(cè)序等手段以保證鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性[5]。

STR 基因座具有高度多態(tài)性和高度突變性[5-6]。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為STR 基因座突變的機(jī)制是復(fù)制滑脫或復(fù)制滑鏈錯(cuò)配，突變按照逐步突變模式發(fā)生，多步突變是通過(guò)逐步突變形成的，步數(shù)越多，發(fā)生突變的機(jī)會(huì)就越小，且重復(fù)的長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)以及位點(diǎn)的大小會(huì)影響位點(diǎn)的突變率[8-11]。同一位點(diǎn)的不同等位基因由于其重復(fù)性不同，突變率可能不同[12]。大量研究報(bào)道了許多中國(guó)人群中不同STR 基因座的突變率，超過(guò)90%的親代與子代間單步突變情況是增加或者減少一個(gè)重復(fù)單位，兩個(gè)或者更多重復(fù)單位改變較少見(jiàn)[13-19]。本研究統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)19 例突變案例發(fā)生20 次等位基因突變，其中19 次一步突變，占95%；1 次兩步突變，僅占5%；一步突變率明顯高于二步突變，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[20]。STR 基因座的突變率會(huì)對(duì)違反遺傳規(guī)律案件中親權(quán)指數(shù)的計(jì)算產(chǎn)生較大影響，親子鑒定選用的遺傳標(biāo)記的突變率應(yīng)低于0.2%[21]。本研究檢測(cè)的vWA 和D12S391 位點(diǎn)突變率最高，均為0.03%。這與以前的研究有一致性[11,22-23]。突變的方向既可以是重復(fù)核心的擴(kuò)增，也可以是壓縮。研究報(bào)道中國(guó)漢族突變方向擴(kuò)增與壓縮比例為1.26∶1[17]。本研究結(jié)果顯示，突變方向擴(kuò)增與壓縮比例為1∶1.375（8/11），可能是由于本研究檢測(cè)的案例數(shù)量不足，觀察的突變次數(shù)較少的緣故。

STR 基因座突變存在性別差異，通常男性突變發(fā)生概率高于女性。本研究結(jié)果顯示，突變來(lái)源有明顯性別差異，父源突變與母源突變的比例為8:1，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12,24]。突變率與細(xì)胞分裂次數(shù)密切相關(guān)，DNA 復(fù)制次數(shù)越多，滑動(dòng)錯(cuò)配的機(jī)會(huì)越大，男性精子細(xì)胞分化經(jīng)歷的細(xì)胞分裂次數(shù)比卵細(xì)胞多10 倍，且精子染色體中堿基替換的積累也較卵細(xì)胞快2 倍[12,25]，故男性STR 突變率更高。